Cell Meter™檢測試劑盒是一套用于監(jiān)測細胞生存力的工具。可以使用多種參數(shù)。該特定試劑盒旨在監(jiān)測細胞凋亡，壞死和健康細胞。凋亡被描述為一種主動的，程序性的自動細胞拆卸過程，可避免引起炎癥。在細胞凋亡中，磷脂酰siansuan（PS）被轉移到質膜的外部小葉。作為細胞凋亡初始/中間階段的通用指標，在觀察形態(tài)變化之前可以檢測到磷脂酰siansuan在細胞表面的出現(xiàn)。該試劑盒中使用的PS傳感器與膜PS結合后具有綠色熒光。壞死的特征是被動的 環(huán)境擾動導致炎癥細胞內容物不受控制釋放而導致意外細胞死亡。膜不透性7-AAD（Ex / Em = 546/647 nm）標記核的能力證明，質膜完整性的喪失代表了晚期凋亡和壞死的簡單方法。此外，該試劑盒還提供了活細胞細胞質標記染料CytoCalcein™Violet 450（Ex / Em = 405/450 nm），用于標記活細胞細胞質。該試劑盒經(jīng)過優(yōu)化，可通過流式細胞儀和熒光顯微鏡檢測細胞凋亡（綠色），壞死（綠色和/或紅色）和健康細胞（藍色）。代表了證明晚期細胞凋亡和壞死的簡單方法。此外，該試劑盒還提供了活細胞細胞質標記染料CytoCalcein™Violet 450（Ex / Em = 405/450 nm），用于標記活細胞細胞質。該試劑盒經(jīng)過優(yōu)化，可通過流式細胞儀和熒光顯微鏡檢測細胞凋亡（綠色），壞死（綠色和/或紅色）和健康細胞（藍色）。代表了證明晚期細胞凋亡和壞死的簡單方法。此外，該試劑盒還提供了活細胞細胞質標記染料CytoCalcein™Violet 450（Ex / Em = 405/450 nm），用于標記活細胞細胞質。該試劑盒經(jīng)過優(yōu)化，可通過流式細胞儀和熒光顯微鏡檢測細胞凋亡（綠色），壞死（綠色和/或紅色）和健康細胞（藍色）。
| 流式細胞儀 | |
| 激發(fā) | 405 nm，488 nm激光 |
| 發(fā)射 | 450/40 nm，530/30 nm，670/14 nm濾光片 |
| 儀器規(guī)格 | 太平洋藍，F(xiàn)ITC，PE-Cy5頻道 |
| 熒光顯微鏡 | |
| 激發(fā) | DAPI，F(xiàn)ITC，德克薩斯紅過濾器 |
| 發(fā)射 | DAPI，F(xiàn)ITC，德克薩斯紅過濾器 |
| 推薦板 | 黑墻/透明底 |
| 組分A：100X Apopxin™綠色 | 1小瓶（200 µL） |
| 組分B：測定緩沖液 | 1瓶（50毫升） |
| 分量C：200X 7-AAD | 1小瓶（100 µL） |
| 成分D：CytoCalcein™紫羅蘭色450 | 1小瓶（凍干粉） |
用測試化合物制備細胞（200 µL /樣品）
添加Apopxin™Green檢測溶液
在室溫下孵育30-60分鐘
使用流式細胞儀對細胞進行分析，流式細胞儀帶有發(fā)射濾光片530/30 nm（對于凋亡細胞為FITC通道），450/40 nm（對于健康細胞為Pacific Blue通道）和670/14 nm（對于壞死細胞為PE-Cy5通道）
重要說明
開始實驗之前，請在室溫下解凍所有試劑盒組件。
儲備溶液的制備
除非另有說明，否則所有未使用的儲備溶液應分為一次性使用的等分試樣，制備后應儲存在-20°C下。避免重復凍融循環(huán)。
1. CytoCalcein™紫羅蘭色450儲備液（200X）：
在CytoCalcein™紫羅蘭色450（成分D）小瓶中加入100 µL DMSO，制成200X CytoCalcein™紫羅蘭色450儲備液。避光。
程序
用Apopxin™Green準備和孵育細胞：
用測試化合物處理細胞一段所需的時間（對于用星形孢菌素處理的Jurkat細胞為4-6小時）以誘導凋亡。
離心細胞以獲得1-5×10 5細胞/管。
將細胞重懸于200 µL分析緩沖液（組分B）中。
向細胞中加入2 µL 100X Apopxin™Green（組分A）。
可選1：向壞死細胞的細胞中加入1 µL 200X 7-AAD（組分C）。
可選2： 然后向細胞中加入1 µL 200X CytoCalcein™Violet 450儲備液，以進行健康細胞染色。
避光保存，在室溫下孵育30至60分鐘。
在使用流式細胞儀或熒光顯微鏡分析細胞之前，添加300 µL分析緩沖液（組分B）以增加體積。
使用流式細胞儀監(jiān)測熒光強度，該流式細胞儀帶有發(fā)射濾光片530/30 nm（對于凋亡細胞為FITC通道），450/40 nm（對于健康細胞為Pacific Blue通道）和670/14 nm（PE-Cy5通道-壞死細胞）細胞）。
使用流式細胞儀分析細胞：
使用流式細胞儀，用發(fā)射濾光片530/30 nm（針對凋亡細胞的FITC通道），450/40 nm（對于健康細胞的Pacific Blue通道）和670/14 nm（對于PE-Cy5通道，針對Apopxin™Green結合）進行定量壞死細胞）。 注意： Apopxin™與貼壁細胞結合的流式細胞儀分析未經(jīng)過常規(guī)測試，因為在細胞分離或收獲過程中可能會發(fā)生特定的膜損傷。然而，Casiola-Rosen等人先前已經(jīng)報道了利用膜聯(lián)蛋白V在貼壁細胞類型上進行流式細胞術的方法。和van Engelend等。
使用熒光顯微鏡分析細胞：
孵育后用移液管吸移細胞懸液，用測定緩沖液沖洗1-2次，然后用測定緩沖液重懸細胞。
將細胞添加到載有玻璃蓋玻片或黑色墻壁/透明底部96孔微孔板的載玻片上。 注意：對于貼壁細胞，建議直接在蓋玻片（或黑色墻壁/透明底部96孔微孔板）上生長細胞。與Apopxin™Green孵育后，用Assay Buffer沖洗1-2次，然后將Assay Buffer加回到蓋玻片（或黑色的壁/透明的底部96孔微孔板）中。將玻片上的蓋玻片倒置并可視化細胞。與Apopxin™Green孵育后，還可以將細胞固定在2％甲醛中，并在顯微鏡下觀察。
使用FITC濾光片在熒光顯微鏡下用Apopxin™Green分析凋亡細胞。當添加7-AAD時，使用Texas Red過濾器測量細胞活力，和/或當將CytoCalcein™Violet 450添加到細胞中時，使用DAPI或Violet過濾器測量細胞活力。質膜上的綠色染色表明Apopxin™Green與細胞表面的PS結合。
22846 Cell Meter™細胞凋亡和細胞壞死檢測試劑盒 *三色熒光* Cell Meter™ Multiplexing Live, Apoptotic and Necrotic Cell Detection Kit III *Triple Fluorescence Colors* 100 Tests 22849 Cell Meter™TUNEL凋亡檢測試劑盒*綠色熒光* Cell Meter™ TUNEL Apoptosis Assay Kit *Green Fluorescence* 50 Tests
