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組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣離子濃度熒光檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū) 主要用途 組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣離子濃度熒光檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子特異性熒光探針Mag-Fluo--AM，與鈣離子結(jié)合后，其熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，在熒光分光光度儀下觀察相對(duì)熒光峰值的變化，來(lái)測(cè)定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中總鈣離子濃度的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種組織（動(dòng)物、人體等）內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子的濃度檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，檢測(cè)敏感。 技術(shù)背景 鈣是人體中的一種重要電介質(zhì)和礦物質(zhì)，占1150克。其中99％的鈣以氟磷灰石鈣（calcium fluorophosphate apatite）形式存在于骨組織中。非骨組織鈣成分主要存在于細(xì)胞內(nèi)。鈣具有兩種主要形式：一種是非彌散型蛋白結(jié)合鈣，其構(gòu)成約40％至50％的血清中的總鈣含量；另一種為彌散型游離鈣，其進(jìn)一步分成具有活性的復(fù)合鈣（complexed calcium）和離子鈣（ionized calcium）。鈣對(duì)神經(jīng)肌肉興奮性（neuromuscular excitability）、血液凝固、酶的激活、離子跨膜運(yùn)輸、釋放神經(jīng)傳導(dǎo)介質(zhì)、信使傳導(dǎo)等方面起著重要作用。在細(xì)胞內(nèi)，鈣離子主要儲(chǔ)存在線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器中。其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子儲(chǔ)存在控制細(xì)胞活化、調(diào)控信號(hào)通路、蛋白分子轉(zhuǎn)錄后修飾，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境鈣離子平衡方面起著重要作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣的檢測(cè)包括沉淀法、EDTA鰲合滴定法、火焰光度法（flame photometry）、原子吸收分光光度法等技術(shù)，但容易受到鈉、鉀、磷酸鹽、硫酸鹽的干擾，或者受限于儀器的特殊的要求，以及需要內(nèi)質(zhì)網(wǎng)純化。Mag-Fluo--AM染料是一種鈣離子低親和性的熒光標(biāo)記染料，特異性地由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)捕獲，可以檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的游離鈣離子濃度的變化。在熒光分光光度儀下，激發(fā)波長(zhǎng)490nm，散發(fā)波長(zhǎng)525nm，來(lái)定量測(cè)定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣濃度。 產(chǎn)品內(nèi)容 清理液（Reagent A） 　 40毫升 染色液（Reagent B） 　30微升 介導(dǎo)液（Reagent C） 　 600微升 通透液（Reagent D） 40微升 飽和液（Reagent E） 　 2毫升 陰性液（Reagent F） 　2毫升 產(chǎn)品說(shuō)明書(shū) 1份 保存方式 保存清理液（Reagent A)染色液（Reagent B）介導(dǎo)液（Reagent C）和飽和液（Reagent E）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月 用戶自備 1.5毫升離心管：用于工作液配制的容器 細(xì)胞培養(yǎng)箱：用于染色孵育 96孔培養(yǎng)板：用于樣品操作的容器 熒光酶標(biāo)儀：用于熒光分析 （共聚焦）熒光顯微鏡：用于熒光染色觀察 實(shí)驗(yàn)步驟 一、測(cè)定準(zhǔn)備 1．設(shè)定好熒光酶標(biāo)儀（22℃）：激發(fā)波長(zhǎng)490nm，散發(fā)波長(zhǎng)525nm 2．準(zhǔn)備好純化的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品，置于冰槽里融化 3．測(cè)定開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent B）室溫下融化，然后分別移出　30　微升介導(dǎo)液（Reagent C）和　1.5　微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，標(biāo)記為染色工作液，并放在暗室里備用。然后進(jìn)行下列操作。 二、熒光酶標(biāo)儀檢測(cè) 1．準(zhǔn)備1個(gè)黑色96孔板，標(biāo)記為：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品孔、空白對(duì)照孔（不含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）、zui大對(duì)照孔（不含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)） 2．移取100微升純化內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品（100微克）到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品孔里 3．加入100微升飽和液（ReagentE）到zui大對(duì)照孔里 4．加入　100　微升陰性液（Reagent F）到空白對(duì)照孔里 5．分別加入　10　微升染色工作液到所有孔里 6．輕輕搖動(dòng)黑色96孔板，混勻 7．室溫下（22℃），孵育30分鐘，避免光照 8．放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育30分鐘，避免光照 9．即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀測(cè)讀：獲得相對(duì)熒光單位（relative fluorescence unit；RFU） 10．計(jì)算樣品內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子濃度 11．【（樣品RFU-空白對(duì)照孔R(shí)FU)÷（zui大對(duì)照孔R(shí)FU-樣品RFU)]×22（微摩爾；解離常數(shù)）=微摩爾/100微克內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 　 三、（共聚焦）或熒光顯微鏡檢測(cè) 1．取出待測(cè)的5至10微米厚的冰凍切片（注意：使用快速冷凍處理－snap frozen的冰凍切片，不宜使用包埋處理） 2．小心加上　500　微升清理液（Reagent A），覆蓋切片樣品表面 3．小心移去切片樣品上的清理液（Reagent A） 4．移取　300　微升清理液（Reagent A）到新的1.5毫升離心管 5．加入　30　微升染色工作液，混勻 6．小心加上上述染色工作液到切片樣品上，覆蓋切片樣品表面 7．室溫下孵育60分鐘，避免光照 8．小心移去染色工作液 9．小心加上200微升新鮮的清理液（Reagent A） 10．小心加上　2　微升新鮮的通透液（Reagent D） 11．放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育4分鐘 12．小心移去通透液 13．小心加上500微升新鮮的清理液（Reagent A） 14．小心移去清理液 15．小心加上100微升新鮮的清理液（Reagent A） 16．蓋上蓋玻片 17．即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察：激發(fā)波長(zhǎng)490nm，散發(fā)波長(zhǎng)525nm（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子呈現(xiàn)綠色） 注意事項(xiàng) 1．本產(chǎn)品為20次（顯微鏡）或60次（酶標(biāo)板）操作 2．操作時(shí)，須戴手套 3．避免使用EDTA等處理樣品 4．孵育反應(yīng)完成后即刻進(jìn)行熒光測(cè)定 5．如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度 6．檢測(cè)敏感度可達(dá)納摩爾級(jí)鈣濃度范圍 7．如果熒光淬滅敏感，建議使用抗淬滅劑1 8．可以使用熒光分光光度儀檢測(cè) 9．本公司提供系列鈣生化檢測(cè)試劑產(chǎn)品 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 1．本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定 2．本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感