質(zhì)粒DNA提取實驗

時間：2013-6-20閱讀：506

質(zhì)粒DNA提取實驗
質(zhì)粒DNA提取可以：（1）快速純化質(zhì)粒；（2）用于測序、體外轉(zhuǎn)錄與翻譯、限制性內(nèi)切酶消化、細菌轉(zhuǎn)化等分子生物學實驗。

質(zhì)粒多為一些雙鏈、環(huán)狀的DNA分子，是獨立于細菌染色體之外進行復制和遺傳的輔助性遺傳單位。質(zhì)粒是進行分子生物學實驗操作，進行遺傳工程改良物種等工作時zui主要的DNA載體。
提取質(zhì)粒的基本步驟分為三步：
①細菌的培養(yǎng)和質(zhì)粒的擴增
②細菌菌體的裂解
③質(zhì)粒DNA的純化
實驗材料大腸桿菌
試劑、試劑盒 Tris-Hcl EDTA 葡萄糖 NaOH KAac NaAc 異丙醇 * 酚:氯仿無水乙醇 LB培養(yǎng)基
儀器、耗材超凈工作臺培養(yǎng)箱搖床恒溫水浴鍋臺式離心機取液器低溫冰箱冷凍真空干燥機電泳儀水平電泳槽紫外觀測儀

一、材料與試劑準備

1. 材料：大腸桿菌。

2. 儀器：超凈工作臺，培養(yǎng)箱，搖床，恒溫水浴鍋，臺式離心機，取液器一套，低溫冰箱，冷凍真空干燥機，電泳儀，水平電泳槽，紫外觀測儀。

3. 試劑：

（1）Solution I ：25 mM Tris-Hcl（pH7.4），10 mM EDTA（pH8.0），50 mM葡萄糖，高壓滅菌，4℃保存。

（2）Solution II ：0.2 M NaOH， 1%SDS 現(xiàn)配現(xiàn)用。

（3）Solution III ：5 N KAc pH4.8，高壓滅菌，4℃保存。

（4）3 M NaAc PH5.2，高壓滅菌，4℃保存。
（5）異丙醇，*（8 mg/ml），酚/氯仿，無水乙醇，70%乙醇，LB培養(yǎng)基，電泳試劑。

二、操作步驟

1. 細菌繁殖：LB培養(yǎng)基，2 ml/20ml，37℃，200 rpm，搖一搖，過夜。

2. 離心10 min，5 000 rpm， 4℃；棄上淸液。

3. 沉淀（菌體細胞）預冷的TES緩沖液洗滌，離心10 min，5 000 rpm， 4℃，加入預冷的1 ml Solution I，冰浴10 min。

4. 重新懸浮，加入150 ul*母液，室溫放置5 min。

5. 加入1.2 ml Solution II，冰浴5 min。

6. 加入0.9 ml預冷乙酸鉀，混勻，離心10 min，12 000 rpm，4℃。

7. 加入1.5 ml異丙醇，-20℃冰箱內(nèi)放置15 min。

8. 離心10 min，12 000 rpm，4℃。

9. 取沉淀，懸于400 ul TE緩沖液中。

10. 加入40 ul，3 M NaAc。

11. 酚/氯仿，抽提，乙醇沉淀。

12. 離心10 min，12 000 rpm，4℃。

13. 取沉淀，冷凍干燥，再懸浮于50 ul TE緩沖液中。

14. 電泳檢測提取DNA的質(zhì)量。

質(zhì)粒DNA提取實驗

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