蛋白胨細(xì)胞培養(yǎng)基冷凍保存及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)的步驟

    培養(yǎng)蛋白胨細(xì)胞時(shí)為防止以下問(wèn)題，細(xì)胞將做冷凍保存：*、株化細(xì)胞產(chǎn)生性狀轉(zhuǎn)變。第二、污染。第三、株化細(xì)胞之增殖或生理特性有特定之限制，只能在一定的代數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行增殖培養(yǎng)或進(jìn)行特定實(shí)驗(yàn)。目前可能解決這些困難的方法其中之一是細(xì)胞冷凍保存法，將冷凍細(xì)胞儲(chǔ)于冷凍管中，將其中一部分拿出來(lái)做一些必要的檢查，其它的冷凍細(xì)胞則在需要時(shí)拿出來(lái)解凍，用來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本方法亦可節(jié)省繼代培養(yǎng)時(shí)所花費(fèi)的勞力、物力，并可防止培養(yǎng)中經(jīng)常發(fā)生意外事故，喪失細(xì)胞珠。因此冷凍保存法為細(xì)胞培養(yǎng)研究上之基本技術(shù)之一。

　　1、準(zhǔn)備2 x 107cells/ml的細(xì)胞懸浮液。

　　2、冷凍用培養(yǎng)基(2倍)：以微溫水溶解DMSO，在培養(yǎng)基中混合為15% (v/v)。這是DMSO的二倍濃度之溶液。必須在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前在行配制，配好后放在冰箱中，使用量必須和細(xì)胞懸浮液的量相等；使用時(shí)維持在4℃。

　　3、分裝：在冷凍管管中分別加0.5ml (1/2冷凍管體積)冷凍用培養(yǎng)基(2倍)及2 x 10(7次方)cells/ml的細(xì)胞懸浮液；等量混合。將蓋子扭緊后，在管中部貼上膠帶密封。

　　4、記載卷標(biāo)：用抗凍marker pen在冷凍管上寫(xiě)明細(xì)胞名稱(chēng)、代數(shù)、冷凍的年，月，日等所需要的項(xiàng)目。

　　5、放進(jìn)冷卻的保利龍容器中，而在- 80℃的超低溫槽中放置一個(gè)晚上。

　　6、放進(jìn)液態(tài)氮容器中及保存：在支持棒上裝上冷凍管，迅速地放進(jìn)容器內(nèi)。

    蛋白胨神經(jīng)細(xì)胞（神經(jīng)元〕不易培養(yǎng)，只有在適宜情況下，如接種在膠原底層上，或加入神經(jīng)生長(zhǎng)因子和膠質(zhì)細(xì)胞因子時(shí)，可出現(xiàn)一定程度的分化，長(zhǎng)出突起等現(xiàn)象，但很難使之增值。而神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)組織中比較容易培養(yǎng)的成分。

　　人、鼠等腦組織即可用于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)，不僅能獲得生長(zhǎng)的膠質(zhì)細(xì)胞，也可形成能傳代的二倍體細(xì)胞系。一般說(shuō)來(lái)，膠質(zhì)細(xì)胞在培養(yǎng)中生長(zhǎng)不穩(wěn)定，不易自發(fā)轉(zhuǎn)化，但對(duì)外界因素仍保持很好的敏感性，可用ROUS病毒和SV4等誘發(fā)轉(zhuǎn)化。

　　蛋白胨神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)方法如下：

　　1、從手術(shù)室無(wú)菌取腦髓灰質(zhì)或白質(zhì)后，仔細(xì)剝除腦膜、血管和纖維成分，置Hanks液中漂洗一、二次。

　　2、置于30—50倍體積的Hanks液中，此時(shí)腦組織比較柔軟，反復(fù)吹打即制成細(xì)胞懸液。

　　3、把懸液注入離心管室溫中直立5—10分鐘后，細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)快自然下沉，脂肪等雜物易漂浮，可吸除上層、反復(fù)二、三次，即可排除脂肪成分和其它碎塊并獲較多細(xì)胞成分。

　　4、在沉降物中加入適量培養(yǎng)液，通過(guò)紗網(wǎng)成紗布過(guò)濾，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度。

　　5、接入培養(yǎng)瓶或皿中，置5%CO2溫箱中培養(yǎng)。

　　該細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境過(guò)程較長(zhǎng)，接種后貼壁較慢。貼壁后短期內(nèi)也可能不見(jiàn)細(xì)胞分裂現(xiàn)象，然而一旦生長(zhǎng)后即能迅速進(jìn)入旺盛的增殖狀態(tài)。細(xì)胞傳代可以0.25%*消化處理。