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技術(shù)文章

Bradford法測(cè)蛋白質(zhì)濃度

閱讀：461發(fā)布時(shí)間：2014-10-16

 

一、實(shí)驗(yàn)原理

考馬斯亮藍(lán)（CBB）測(cè)定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種。考馬斯亮藍(lán)在游離狀態(tài)下呈紅色，zui大光吸收在488nm;當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌鞍踪|(zhì)—色素結(jié)合物在595nm波長(zhǎng)下有zui大光吸收。其光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比，因此可用于蛋白質(zhì)的定量測(cè)定。蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)結(jié)合在2min左右的時(shí)間內(nèi)達(dá)到平衡，完成反應(yīng)十分迅速;其結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。該法試劑配制簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便快捷，反應(yīng)非常靈敏，靈敏度比Lowry法還高4倍，可測(cè)定微克級(jí)蛋白質(zhì)含量，測(cè)定蛋白質(zhì)濃度范圍為0～1 000μg/ml，是一種常用的微量蛋白質(zhì)快速測(cè)定方法。

二、實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.準(zhǔn)備所需的藥品和儀器。

2.計(jì)算所需配制的溶液的量。

先配制1 mg/ml的牛血清蛋白（BSA）母液，再往母液中加入磷酸緩沖溶液（PBS）配制一組濃度分別為1.0mg/ml ，0.8mg/ml，0.6mg/ml ，0.4mg/ml ，0.2mg/ml的BSA溶液，再將這組溶液稀釋10倍，得到一組濃度分別為0.10mg/ml ，0.08mg/ml，0.06mg/ml ，0.04mg/ml ，0.02mg/ml的BSA溶液。計(jì)算*步稀釋各組需要的BSA溶液及PBS溶液的體積。

3.具體操作過(guò)程。

用天平稱(chēng)量1.00g牛血清蛋白（BSA），溶于去離子水中，配成100ml的溶液，溶液的濃度為10mg/ml。用移液槍分別取100ul，80ul，60ul，40ul，20ul的BSA溶液，置于1.5ml的EP管中，再分別加入900ul，920ul，940ul，960ul，980ul的磷酸緩沖溶液（PBS）配成1ml的溶液，震蕩使溶液混合均勻。得到一組濃度分別為1.0mg/ml ，0.8mg/ml，0.6mg/ml ，0.4mg/ml ，0.2mg/ml的BSA溶液。

移液槍分別移取100ul剛配好的一組BSA溶液，置于1.5ml的EP管中，各加入900ul的PBS溶液，震蕩使溶液混合均勻。得到一組濃度分別為0.10 mg/ml ，0.08mg/ml，0.06mg/ml ，0.04mg/ml ，0.02mg/ml的BSA溶液。另外量取1ml的PBS溶液（BSA溶液濃度為0 mg/ml）作對(duì)照試驗(yàn)。

用移液槍分別移取50ul配好的一組BSA溶液，滴加到孔板中，再分別加入200ul的考馬斯亮藍(lán)（CBB）。靜置10min后，用酶標(biāo)儀測(cè)得這組BSA溶液的吸光度。

 


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