一、酶免ELISA試劑盒特異性因素
1、固相載體的選擇.ELISA中常用的固相載體有微量滴定板、小珠和小試管三種,以微量滴定板為常見.它具有良好的吸附性能,孔底透明度高,空白值低,各板之間、同一板各孔之間性能相近.聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別,各產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大.因此,在選擇試劑盒同時(shí)要對(duì)其使用的微孔板型號(hào)進(jìn)行認(rèn)證,評(píng)估。
2、包被物的純度.在酶聯(lián)免疫測(cè)定尤其是間接ELISA中,試劑的特異性取決于使用抗原的純度.目前由于技術(shù)條件的限制,包被用抗原或抗體的純度不可能達(dá)到100%,所以有些非特異性顯色不可避免,只能盡可能提高純度,提高特異性.目前使用的包被抗原一般為合成多肽抗原.
3、包被抗體的效價(jià).具有高親和力和高特異性的包被抗體,是決定試劑特異性的重要方面。
4、封閉.是ELISA中重要的一步,目的是封閉固相載體表面尚未被所占據(jù)的空隙,減少后續(xù)步驟中非特異性蛋白的干擾。
二、檢驗(yàn)標(biāo)本中含有酶標(biāo)記物的干擾物
1、內(nèi)源性干擾物:類風(fēng)濕因子（RF）、黃疸等,類風(fēng)濕因子是可作用于多種動(dòng)物以及人IgGFc段的自身抗體,多數(shù)為IgM類,能充當(dāng)抗原成分與固相及酶標(biāo)抗體反應(yīng),從而呈現(xiàn)非特異性顯色。
2、外源性干擾物,常常因樣品采集、貯存、處理不當(dāng)造成如樣品溶血,被細(xì)菌污染,標(biāo)本凝集不全等.溶血標(biāo)本,紅細(xì)胞溶解破裂,釋放出血紅素形成,而血紅素中的鐵卟啉是過氧化物酶的類似物,以HRP為標(biāo)記的ELISA測(cè)定中,溶血標(biāo)本可能會(huì)增加非特異性顯色.如有細(xì)菌污染,菌體中可能含有內(nèi)源性HRP（辣根過氧化酶）,有國內(nèi)報(bào)道酶免HBsAg試劑檢測(cè)溶血標(biāo)本時(shí)可造成假陽性。
三、操作過程中的問題造成假陽性
1、加樣 ：對(duì)于間接ELISA標(biāo)本一般都要進(jìn)行稀釋,如果加樣不準(zhǔn)就會(huì)造成誤差,尤其當(dāng)稀釋倍數(shù)大時(shí),很小的誤差,會(huì)導(dǎo)致較大的相對(duì)誤差,使陰性（或弱陽性）標(biāo)本呈陽性（或陰性）.加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部,避免加在孔壁上部,并注意不可濺出,不可產(chǎn)生氣泡。
2、洗滌：在ELISA中正確的洗滌是保證得到可重復(fù)結(jié)果的關(guān)健一步,應(yīng)引起操作者重視.無論是手工操作還是機(jī)器操作,得出不正確的結(jié)果常與不正確的洗滌有關(guān),ELISA就是靠洗滌來達(dá)到分離游離和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的.通過洗滌以消除殘留在板孔中沒能與固體抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì),以及在反應(yīng)過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。
3 、溫育 ：每種試劑都有其好的反應(yīng)模式,其中溫度和溫育時(shí)間控制是重要因素.因孵育溫度高,反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng),會(huì)造成整板本底高,陽性率高.溫育一般用濕盒或水浴,反應(yīng)板不宜疊放,以保證各板溫度都能迅速平衡,為避免蒸發(fā),板上應(yīng)加蓋。
4、酶標(biāo)儀判讀 ：作為記錄測(cè)定結(jié)果的儀器,酶標(biāo)儀的性能穩(wěn)定與否,決定結(jié)果的可靠度.首先酶標(biāo)儀應(yīng)定期進(jìn)行保養(yǎng),對(duì)濾光片要定期校正;其次酶標(biāo)儀波長(zhǎng)設(shè)置要正確,使用雙波長(zhǎng),一個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng),一個(gè)參比波長(zhǎng),以消除微孔板底部劃痕、不平、指印或液面高度差異造成的光干擾.此外,在用酶標(biāo)儀讀數(shù)時(shí)應(yīng)先擦試微孔板底部并壓平板條。
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