預(yù)雜交液的制備：根據(jù)要雜交的膜的數(shù)量配制預(yù)雜交液，每25ml預(yù)雜交液（1~2張膜）的成分組成如下：
　　
　　H2O15ml
　　
　　20×SSPE6.25ml
　　
　　50×Denhardt2.5ml
　　
　　10%SDS1.25ml
　　
　　100mg/ml鮭魚精DNA（緩加）400ml
　　
　　1、取適量小麥基因組DNA，用適量的限制性內(nèi)切酶消化*（約5U/mgDNA，酶切12h左右），取少量電泳檢測酶切*性；然后依次用酚：氯仿和氯仿：異戊醇抽提，乙醇沉淀。而后溶解在20mlTEBuffer中；
　　
　　2、在1%的瓊脂糖凝膠上電泳10~12h，電壓為3V/cm；
　　
　　3、電泳完畢后，將膠轉(zhuǎn)入EB染色液中，染色10min，紫外燈下檢測酶切結(jié)果；
　　
　　4、將膠轉(zhuǎn)入500ml0.25N的HCl中，脫嘌呤15~30min，直至溴酚藍(lán)變黃，用水洗一下；
　　
　　5、0.4N的NaOH處理20min。與此同時，尼龍膜在超純水中潤濕后，在0.4N的NaOH中泡5min以上；
　　
　　6、將凝膠翻轉(zhuǎn)后放在濾紙橋上，放上一張與凝膠大小相當(dāng)?shù)哪猃埬ぃ℉ybond-N+，Amarsharm），趕除氣泡，在膜上放3層濾紙，與尼龍膜大小相同，趕除氣泡，將凝膠周圍用膠片封好，放上大小相當(dāng)?shù)奈?，壓上約500g的重物，轉(zhuǎn)膜10h以上，其間更換吸水紙；
　　
　　7、標(biāo)記點樣孔一角，然后放在2×SSC中浸泡10min，并進(jìn)行輕微震蕩。用濾紙吸干，保鮮膜包好，置4℃存放備用；
　　
　　8、利用HYBAID固相雜交儀進(jìn)行預(yù)雜交、雜交。雜交瓶中根據(jù)膜面積大小，加入10~20ml預(yù)雜交液，預(yù)熱到65℃，然后放入尼龍膜。65℃，預(yù)雜交5~6h；
　　
　　9、采用Takara公司RandomprimerDNAlabelingkit進(jìn)行探針標(biāo)記，取適量待標(biāo)記的DNA。片段和Randomprimer2ml，加入ddH2O至終體積14ml，95℃變性3min后立即冰浴5min，瞬時離心。然后在此管中，依次加入：
　　
　　10×buffer2.5ml
　　
　　dNTPMixture2.5ml
　　
　　Klenow酶1ml
　　
　　α-32P-dCTP5ml
　　
　　輕輕混勻，37℃反應(yīng)30min~1h。然后65℃反應(yīng)5min，95℃反應(yīng)3min后迅速置于冰上冷卻；
　　
　　10、將變性后的探針加到預(yù)雜交液中，繼續(xù)于65℃雜交約12h；
　　
　　11、用2×SSC/0.5%SDS洗膜液于65℃洗膜15min，重復(fù)1次。然后，再用0.2×SSC/0.5%SDS洗膜液于65℃洗膜15min，重復(fù)1次；
　　
　　12、檢測雜交信號與背景情況，直至探測器探測的信號為10個counters左右，用濾紙吸干雜交膜，用保鮮膜包好，壓磷屏；
　　
　　13、尼龍膜可以反復(fù)進(jìn)行分子雜交，去除尼龍膜上原雜交探針的方法如下：將0.1×SSC/0.5%SDS洗液加熱到100℃，放入雜交膜，在大于95℃條件下洗5min，重復(fù)3次，將洗好的雜交膜放入2×SSC中漂洗5min，濾紙吸干，保鮮膜包好，4℃存放。
　　
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