研究目的

        DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)研究的重點(diǎn)，是基因調(diào)控的手段之一，在維持細(xì)胞正常功能、傳遞基因組印記、胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生等方面起著至關(guān)重要的作用。基于不同的新一代測(cè)序研究方案，檢測(cè)表觀遺傳學(xué)變異尤其是基因組的甲基化，探討甲基化對(duì)于生物學(xué)功能的影響，并篩選可應(yīng)用作為疾病早期診斷、分級(jí)和分型的分子標(biāo)記。

研究對(duì)象和取材

        研究對(duì)象：各類(lèi)腫瘤、發(fā)育、干細(xì)胞分化的不同階段。

        取樣標(biāo)準(zhǔn)：腫瘤組織與正常組織有明顯區(qū)別，組織病理切片分析腫瘤樣品中腫瘤細(xì)胞的比例在80%以上;正常樣品中幾乎不含有腫瘤細(xì)胞，或以血液作為正常對(duì)照。

新一代測(cè)序方案

        RRBS (Reduced Representation Bisulfite Sequencing)基于MspⅠ酶切消化和bisulfite處理的高性價(jià)比方法，可對(duì)基因組promoter區(qū)及CpG島區(qū)域的DNA甲基化狀態(tài)進(jìn)行樣品之間的比較分析。

        MBD-Seq(Methylated DNA Binding Domain Sequencing)由于在哺乳動(dòng)物中甲基化一般發(fā)生在CpG的胞嘧啶5位碳原子上，所以可通過(guò)特異性結(jié)合甲基化DNA的蛋白MBD2b富集高甲基化的DNA片段，并結(jié)合第二代高通量測(cè)序，對(duì)富集到的DNA片段進(jìn)行測(cè)序，從而檢測(cè)全基因組范圍內(nèi)的甲基化位點(diǎn)。

        MeDIP-Seq(Methylated DNA Immunoprecipitation Sequencing )通過(guò)使用5' -甲基胞嘧啶抗體富集高甲基化的DNA片段，然后將富集后的DNA進(jìn)行高通量測(cè)序。

        BS(Bisulfite Sequsencing)Bisulfite處理能夠?qū)⒒蚪M中未甲基化的C堿基與甲基化的C堿基區(qū)分開(kāi)來(lái)，因此成為表觀遺傳學(xué)研究的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)方法。將Bisulfite處理與高通量測(cè)序技術(shù)的結(jié)合的Bisulfite Sequencing能夠繪制單堿基分辨率的DNA甲基化圖譜，可用于研究特定DNA區(qū)域甲基化與特定表型之間的關(guān)聯(lián)。

案例解讀

案例(一)RRBS作為一種高性價(jià)比的甲基化研究方法，在大規(guī)模臨床樣本的研究中具有廣泛的應(yīng)用前景

        RRBS是一種準(zhǔn)確、、經(jīng)濟(jì)的DNA甲基化研究方法，通過(guò)酶切富集啟動(dòng)子及CpG島區(qū)域，并進(jìn)行Bisulfite測(cè)序，同時(shí)實(shí)現(xiàn)DNA甲基化狀態(tài)檢測(cè)的高分辨率和測(cè)序數(shù)據(jù)的高利用率。研究者進(jìn)行了全基因組甲基化測(cè)序(BS)和RRBS的比較，發(fā)現(xiàn)RRBS在啟動(dòng)子，CpG島區(qū)域具有更高的覆蓋倍數(shù)，并且RRBS和BS具有很好的相關(guān)性。RRBS可作為一種更經(jīng)濟(jì)的研究方法，在大規(guī)模臨床樣本的研究中具有廣泛的應(yīng)用前景。

圖1. RRBS和BS在CpG島平均覆蓋深度的比較，其中RRBS的測(cè)序數(shù)據(jù)為6G，BS的測(cè)序數(shù)據(jù)是103.5G



圖2. RRBS和BS甲基化水平的相關(guān)性分析

案例(二)運(yùn)用ERRBS甲基化測(cè)序研究前列腺癌

        研究者通過(guò)Enhanced Reduced Representation BisulfiteSequencing(ERRBS)對(duì)7個(gè)局限性前列腺癌(PCa)組織樣本，7個(gè)對(duì)應(yīng)的良性前列腺(Ben)組織樣本，6個(gè)去勢(shì)抵抗前列腺癌(CRPC)組織樣本進(jìn)行了高通量測(cè)序。通過(guò)對(duì)三組樣本的分析，發(fā)現(xiàn)甲基化程度隨著疾病嚴(yán)重程度的增加而增加，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)大部分的PCa甲基化改變發(fā)生在等位基因特異甲基化區(qū)域。

B.韋恩圖顯示從Ben到PCa和從PCa到CRPC的甲基化程度增加的CpG島區(qū)域的交集

案例(三)運(yùn)用MBD-seq找到神經(jīng)母細(xì)胞瘤預(yù)后甲基化生物標(biāo)志

        研究者通過(guò)methyl-CpG-binding domain (MBD-seq)方法，對(duì)8個(gè)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系進(jìn)行了高通量測(cè)序。通過(guò)高通量測(cè)序，初步篩查到了43個(gè)候選的生物標(biāo)志。后期研究者又通過(guò)在89個(gè)初級(jí)神經(jīng)母細(xì)胞瘤腫瘤樣本中進(jìn)行進(jìn)一步的PCR驗(yàn)證，zui后篩查出了HIST1H3C 和GNAS的甲基化水平和總生存率以及無(wú)事件存活率相關(guān)。

圖4. HIST1H3C 和GNAS的甲基化水平和總生存率以及無(wú)事件存活率的相關(guān)性分析。U代表未甲基化的病例，M代表甲基化的病例

案例(四)通過(guò)MeDIP-seq找到了急性髓細(xì)胞白血病*的甲基化區(qū)域

        研究者通過(guò)對(duì)12個(gè)急性髓細(xì)胞白血病(AML)病人和4個(gè)正常人的骨髓進(jìn)行了MeDIP-seq。通過(guò)聚類(lèi)分析，找到了AML的*的甲基化區(qū)域。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，SPHKAP, DPP6, ID4這三個(gè)基因在AML中表達(dá)量很低，用去甲基化的藥物處理后，這些基因的表達(dá)量都有不同程度的升高。

圖5. SPHKAP, DPP6 和ID4 在AML中的表達(dá)量。(A.1, B.1, C.1) 分別代表SPHKAP, DPP6, ID4 在AML和正常組織中的
表達(dá)水平(A.2,B.2, C.2)分別代表SPHKAP, DPP6, ID4在 OCI-AML2和CTS細(xì)胞系用DAC處理前后的表達(dá)水平。

參考文獻(xiàn)

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