細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)

摘要：在293T細(xì)胞中過表達(dá)human pescadillo（PES1）基因，利用免疫熒光技術(shù)研究PES1在細(xì)胞中的表達(dá)和定位。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PES1定位于細(xì)胞核的核仁。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步深入研究PES1基因的功能提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
關(guān)鍵詞：PES1，免疫熒光， 蛋白定位，293T

一、 實(shí)驗(yàn)原理
免疫熒光細(xì)胞化學(xué)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物，再用這種熒光抗體(或抗原)作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體)。在細(xì)胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光(黃綠色或桔紅色)，可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測(cè)定含量。

二、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>
使用過表達(dá)PES1-3FLAG的慢病毒感染293T細(xì)胞，利用Anti-FLAG抗體進(jìn)行免疫熒光，觀察PES1蛋白的表達(dá)以及在細(xì)胞中的定位。

三、 實(shí)驗(yàn)步驟
1. 細(xì)胞鋪板：
細(xì)胞鋪板：將細(xì)胞按20-30%的匯合度接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的圓形蓋玻片上。
2. 病毒感染：
病毒感染：細(xì)胞貼壁后使用PES1過表達(dá)慢病毒感染細(xì)胞，MOI =10。
3. 免疫細(xì)胞化學(xué)染色：
1) 固定：病毒感染72h后，吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔用500μl DPBS洗細(xì)胞2次，之后每孔加250μl 4% 多聚甲醛，室溫固定15-20min。
2) 封閉：封閉液配制如下：
                  94%    0.1M TBS
                  3%     Normal Goat Serum
                  3%     10% Triton X-100
去除TBS，24孔板每個(gè)孔加入500μl封閉液，室溫孵育1h封閉。
3) 染一抗：吸出封閉液，每個(gè)孔再加入500μl封閉液，根據(jù)1:1000加入一抗，4℃孵育過夜。
4) 染二抗：一抗染色結(jié)束后，移去含一抗的封閉液，用1ml TBS洗三次。吸出TBS，每個(gè)孔加入500μl封閉液孵育30min。按1:500加入二抗，室溫?fù)u晃孵育60-120min?？稍诜跤?0min后加入終濃度為100ng/ml的DAPI繼續(xù)孵育。由于二抗帶有熒光標(biāo)記，熒光信號(hào)容易淬滅，加入二抗及之后的過程需注意避光。二抗孵育結(jié)束后，移去含二抗的封閉液，用1ml TBS洗三次，可直接在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察或者進(jìn)行封片保存。
5) 封片：在載玻片是滴一小滴mounting medium，小心地將cover slip從細(xì)胞培養(yǎng)板中取出，種植有細(xì)胞面朝下輕輕地蓋在mounting medium。4℃孵育過夜晾干。過程中要注意避免產(chǎn)生氣泡，mounting medium很粘稠，滴加的時(shí)候需小心。

4. 共聚焦熒光顯微鏡拍照：
封片后可在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，亦可置于4℃長(zhǎng)期保存。

四、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

                                                                      圖1. 低倍鏡觀察PES1蛋白在293T細(xì)胞中的定位

                                                                         圖2. 高倍鏡觀察PES1蛋白在293T細(xì)胞中的定位

 從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看到PES1蛋白定位在細(xì)胞的核仁位置。

五、 參考文獻(xiàn)
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