人AAVS1位點(diǎn)的TALENs質(zhì)?；钚则?yàn)證

摘要：利用T7E1 活性分析實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證AAVS1位點(diǎn)的TALENs質(zhì)粒對的活性。實(shí)驗(yàn)表明，該質(zhì)粒對可以識別CCCCTCCACCCCACAGT和TTTCTGTCACCAATCCT序列，切割效率約為10%。配合Donor質(zhì)粒，可以地將外源基因定點(diǎn)插入到AAVS1位點(diǎn)?？捎糜诤Y選定點(diǎn)整合穩(wěn)定細(xì)胞株。
關(guān)鍵詞：T7E1，AAVS1，TALENs， 定點(diǎn)整合穩(wěn)定細(xì)胞株

一、 實(shí)驗(yàn)原理
在293T細(xì)胞中共轉(zhuǎn)針對AAVS1位點(diǎn)的TALENs質(zhì)粒， TALENs質(zhì)粒會表達(dá)相應(yīng)的蛋白如果具有切割活性將會在識別位點(diǎn)中間預(yù)測的位置造成DNA雙鏈斷裂，在細(xì)胞進(jìn)行易錯修復(fù)后造成隨機(jī)的突變(一般會缺失部分堿基，某些情況下也會添加)。當(dāng)利用引物切割位點(diǎn)上下游的引物進(jìn)行PCR的時候，產(chǎn)物為兩類PCR產(chǎn)物的混合物：正常序列的PCR產(chǎn)物和突變序列的PCR產(chǎn)物。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行變性和退火以后，這兩類產(chǎn)物會隨機(jī)配對，會有一部分正常序列的PCR產(chǎn)物和突變序列的PCR產(chǎn)物組成雜合鏈。在使用可以特異識別不*配對區(qū)域的T7E1酶處理后，雜合鏈將會被切斷。利用DNA PAGE膠，相對于對照組會有預(yù)測大小的切割條帶出現(xiàn)。如果TALENs質(zhì)粒沒有活性，則不會有切割條帶出現(xiàn)。

二、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>
驗(yàn)證識別CCCCTCCACCCCACAGT和TTTCTGTCACCAATCCT序列的TALENs切割質(zhì)粒對在293T細(xì)胞中的切割活性。

三、 實(shí)驗(yàn)步驟
1. 引物設(shè)計合成：
AAVS1-F1-311 : CCTGTCATGGCATCTTCC
AAVS1-R1-311 : TAAGGAATCTGCCTAAC
位于TALENs識別位點(diǎn)上下游，可獲得311bp長PCR產(chǎn)物，用于T7E1實(shí)驗(yàn)。
2. TALENs細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備：
293T細(xì)胞70%匯合度時按照轉(zhuǎn)染試劑說明書，共轉(zhuǎn)AAVS1 TALENs質(zhì)粒， 同時轉(zhuǎn)染TALENs空質(zhì)粒作為對照， 轉(zhuǎn)染3天后， 收集樣品， 抽提基因組DNA。
3. PCR：將基因組DNA作為模板，使用AAVS1-R1-311和AAVS1-F1-311引物進(jìn)行PCR，得到311bp產(chǎn)物。

                                                                   PCR反應(yīng)體系

                                                           PCR循環(huán)條件
                                           

                                                           1    2    3

1． Con
2． TALENs treated
3． DL2,000 DNA  Marker： 2 kb， 1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp

4. T7E1活性分析實(shí)驗(yàn)-退火：
取以上PCR產(chǎn)物(311bp)各10μl， 放入PCR按照以下程序進(jìn)行退火： 95℃ 5 min， 以-2度/秒的速度降至85度，再以-0.1度/秒降至25度， 4℃保存。
5. T7E1活性分析實(shí)驗(yàn)-酶切：
每個樣品加入1μl T7E1酶，37℃酶切40min。
6. T7E1活性分析實(shí)驗(yàn)-DNA PAGE電泳，染色：
酶切好的樣品加入5X Orange G 上樣緩沖液，在12%的聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳，使用1XTBE作為電泳緩沖液，恒壓80V電泳15min后150V電泳至 Orange G染料至底部。凝膠取下后，在50ml 1XTBE 中加入10μl gold view 染料，搖床震蕩10min后，用去離子水洗三次。紫外凝膠成像儀觀察，拍照。

                                   
                                             圖1. T7E1切割活性檢測PAGE膠電泳圖

四、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
T7E1活性分析實(shí)驗(yàn)結(jié)論：
TALENs轉(zhuǎn)染組的T7E1酶切后可見兩條預(yù)測大小的切割條帶（~208bp，~103bp），在對照組同樣位置沒有發(fā)現(xiàn)同樣大小的條帶。結(jié)果證實(shí)pTALEN-AAVS1-F和pTALEN-AAVS1-R質(zhì)粒對在293T細(xì)胞中具有切割活性。經(jīng)過灰度分析，切割效率約為10%。

五、 參考文獻(xiàn)
1. Ramakrishna S, Kim YH, Kim H.Stability of zinc finger nuclease protein is enhanced by the proteasome inhibitor MG132. PLoS One. 2013;1:e54282