側向層析技術介紹

1、側向層析，也叫側向流層析、側流層析，在POCT技術中，應用最為廣泛。側向層析技術是20世紀90年代在單克隆抗體技術、膠體金免疫層析技術和新材料技術基礎上發(fā)展起來的一項新型體外診斷技術，具有快速、簡便、單人份檢測、經(jīng)濟的優(yōu)點，現(xiàn)已廣泛應用于醫(yī)學檢測、食品質量監(jiān)測、環(huán)境監(jiān)測、農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)、出入境檢驗檢疫、法醫(yī)定案等領域。

側向層析技術以大孔徑的微孔濾膜（NC膜、硝酸纖維素膜）為載體，將特異性的抗原或抗體固定在NC膜上，當待測樣品加到試紙條一端的樣品墊上后，通過毛細作用側向移動，與結合墊上的膠體金或微球標記的試劑發(fā)生特異的免疫反應，再移動到NC膜上，被固定在NC膜表面的抗原或抗體捕獲，聚集在檢測帶上，通過目測硝酸纖維素表面標記物（膠體金或乳膠顆粒）的光反射信號的密度得到直觀的顯色結果。其它未結合的標記物則越過檢測帶，流入吸水墊中，達到自動分離的目的。

2、分類

按照檢測物的類別劃分，可以分為兩大類，分為免疫層析和核酸層析，在免疫層析中又可分為抗體檢測和其他檢測（抗原、激素等）2個子類。

也有按照出結果的方式不同，分為定性和定量、半定量。

還有根據(jù)顯色物或信號物質、標記物質不同分為：有色側流層析、熒光側流層析、磁信號側流層析等。

很多人將POCT看成側流層析，這是很大的誤解，側流層析是POCT技術中很小的一部分，以后會慢慢介紹的，是樹木和森林的關系。

根據(jù)標記物的種類不同分類

3、任何事物都有兩面性，側向層析技術也不例外

優(yōu)點：一步檢測，沒有多余的清洗過程

          多通道、單通道可靈活選配，占用空間小

          快速、低成本、少的樣本量

          無需機器也可判讀定性和半定量的結果

          短的研發(fā)周期可快速投放市場產(chǎn)生利潤

          很少的樣本檢測程序

          滿足即時檢測和床邊檢測

          可以檢測物質種類繁多，包括蛋白、半抗原、核酸、擴增產(chǎn)物等

          較好的滿足單人份檢測和中等批量的檢測量

          長的產(chǎn)品效期，不需要冰箱，可提前備貨

          對于液體的樣本，幾乎不需要前處理或者僅需要離心

缺點：

          不精確的加樣量減少準確度（滴管、毛細采血管等）

          人工操作步驟較多，存在誤差

          樣本的加樣量少是限制敏感性的一個因素

          顯示信號沒有經(jīng)過酶等二次放大

          結果判讀采用比色卡或圖形掃描、讀條儀、CCD，存在影響

          對原材料抗體或抗原等要求較高

          分析時間取決于樣本的性質和粘度

          膜的孔徑結構，膜孔徑大小有差異的阻礙，造成精密性差異

          非液體樣本需要前處理          

4、側向層析卡板的結構（以膠體金免疫層析（雙抗體夾心法）為例）。

5、膠體金技術簡介

膠體金是一種常用的標記技術，是以膠體金作為示蹤標志物應用于抗原抗體的一種新型的免疫標記技術，有其*的優(yōu)點。近年已在各種生物學研究中廣泛使用。在臨床使用的免疫印跡技術幾乎都使用其標記。同時在流式、電鏡、免疫、分子生物學以至生物芯片中都得到了廣泛的應用。

膠體金也稱金溶膠，是金鹽被還原成子金后形成的金顆粒懸液，膠體金是由氯金酸(HAuCl4)在還原劑如白磷、抗壞血酸、鞣酸等作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，形成帶負電的疏水膠溶液，由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱膠體金。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負電荷，可與蛋白質分子的正電荷基團形成牢固的結合，由于這種結合是靜電結合，所以不影響蛋白質的生物特性。

膠體金除了與蛋白質結合以外，還可以與許多其它生物大分子結合，如SPA、PHA、ConA等。根據(jù)膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應，加上結合物的免疫和生物學特性，因而使膠體金廣泛地應用于免疫學、組織學、病理學和細胞生物學等領域。

6、膠體金常用檢測技術

6.1、快速膠體金免疫滲濾法（80年代）

主要由兩部分組成：膜滲濾裝置和標記結合物。前者為一塑料小盒，其中填滿吸水性物質，面上緊貼放置一片吸附有抗體(以雙抗體夾心法測抗原為例)的硝酸纖維膜，標記結合物為免疫金。

6.2、膠體金免疫層析法（90年代）

免疫層析法中滴加在膜一端的樣品溶液受膜的毛細管作用(基于層析作用的橫流)向另一端移動。移動過程中被分析物與固定在膜上某一區(qū)域的受體(抗原或者抗體)結合而被固相化，無關物質則越過該區(qū)域而被分離，然后通過標記物顯色來判定試驗結果。

6.3、免疫膠體金光鏡染色法

細胞懸液涂片或組織切片，可用膠體金標記的抗體進行染色，也可在膠體金標記的基礎上，以銀顯影液增強標記，使被還原的銀原子沉積于已標記的金顆粒表面，可明顯增強膠體金標記的敏感性。

6.4、免疫膠體金電鏡染色法

可用膠體金標記的抗體或抗抗體與負染病毒樣本或組織超薄切片結合，然后進行負染?？捎糜诓《拘螒B(tài)的觀察和病毒檢測。

6.5、快速金標試劑技術

是將特異的抗體先固定于酸類纖維素膜的某一區(qū)帶，當該干燥的酸類纖維素一端浸入樣品（尿液或血清）后，由于毛細管作用，樣品將沿著該膜向前移動，當移動至固定有抗體的區(qū)域時，樣品中相應的抗原即與該抗體發(fā)生特異性結合。同時利用金粒具有高電子密度的特性，在金標蛋白結合處。當這些標記物在相應的配體處大量聚集時，肉眼可見紅色的斑點。既為快速的金標檢測方法原理。生產(chǎn)快速而精確試劑，要點在于所采用的單克隆抗體、多元克隆抗體、抗原、半抗原、蛋白嵌合物及膠體金等原料的靈敏性及特異性等是否能達到最高的標準，此為金標試劑的質量之重要的標準。

目前在醫(yī)學檢驗中的應用主要是免疫層析法(immunochromatogra-phy)和快速免疫金滲濾法(Dot-immuogold filtration assay DIGFA)，用于檢測 HBsAg、HCG 和抗雙鏈DNA抗體等，具有簡單、快速、準確和無污染等優(yōu)點。

7、膠體金免疫滲濾技術

技術原理：膠體金免疫滲濾技術也采用膠體金作為示蹤物，基于抗原和抗體結合的原理，不同之處在于滲濾技術層析方向是垂直的。

8、膠體金免疫層析技術

8.1、膠體金免疫層析技術也是膠體金免疫色譜技術，是20世紀80-90年代，在酶聯(lián)免疫吸附試驗、乳膠凝集試驗、單克隆抗體技術、膠體金免疫技術和新材料技術基礎上發(fā)展起來的一種新型的體外診斷技術，英文全稱Colloidal Gold Immunochromatoaraphy Assay，縮寫GICA。

8.2、膠體金免疫層析技術發(fā)展歷程

1971年，F(xiàn)aulk和Taylor發(fā)明了膠體金標記蛋白質的方法，應用于免疫組化；

1973年，F(xiàn)rens G發(fā)明了檸檬酸鈉還原氯金酸制備膠體金的方法；

1984年，第一次用膠體金在NC膜上實現(xiàn)了抗原的可視化檢測；

20世紀80年代后期，第一次用膠體金在NC膜上實現(xiàn)了抗原的可視化檢測。

8.3、膠體金免疫層析技術有三種反應模式：雙抗體夾心法、間接法、競爭抑制法。

雙抗體夾心法：雙抗體夾心法主要用于大分子量蛋白（抗原）的檢測。要求兩株抗體針對一個抗原的不同位點才可以，例如FABP、cTnI、CK-MB等檢測項目。也有個別項目是雙抗原夾心檢測抗體的，原理類似。

間接法：間接法主要用于血清中抗體檢測，純化或者重組的抗原固定于NC膜上，標記大多為蛋白A，例如HIV、人狂犬病毒IgG檢測試劑盒(膠體金法)等。間接法要求金標蛋白過量，一般來說樣品在加入之前需要稀釋。膠體金免疫滲濾技術一般使用的就是間接法。

競爭法：競爭法主要用于小分子抗原（d品、農(nóng)藥、肽鏈）的檢測。由于小分子抗原不能直接固定于NC膜上，常常用化學方法把小分子偶聯(lián)到BSA等大分子物質上再固定于NC膜上。此結果判讀方法與夾心法和間接法相反，陽性是只有C線顯現(xiàn)，陰性是CT線都有。

9、基于顯色原理的層析技術

10、分子發(fā)光原理

S0：基態(tài)；S1：第一電子激發(fā)單重態(tài)；S2：第二電子激發(fā)單重態(tài)；T1：第一電子激發(fā)三重態(tài)；T2：第二電子激發(fā)三重態(tài)。

室溫下，大多數(shù)分子處于基態(tài)的低振動能級。處于基態(tài)的分子吸收能量后被激發(fā)為激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定，返回基態(tài)時伴隨著光子的輻射，此即為“發(fā)光"。

由激發(fā)單重態(tài)低振動能級躍遷回基態(tài)，并伴隨光子的輻射，稱為“熒光發(fā)射"；

由激發(fā)三重態(tài)低振動能級躍遷回基態(tài)，并伴隨著光子的輻射，稱為“磷光發(fā)光"。

11、熒光免疫層析簡介

反應原理：免疫層析；

標記物：熒光物質；

檢測對象：T線及C線熒光強度。

熒光物質的要求：

熒光信號強度高，摩爾消光系數(shù)大；

斯托克斯位移大；

激發(fā)光譜寬，發(fā)射光譜窄；

熒光壽命長，熒光信號穩(wěn)定。

12、磁免疫層析技術簡介

磁性免疫層析，指的是利用超順磁性納米微球代替膠體金等常規(guī)材料構建的一種基于免疫層析的試紙條，并利用磁信號檢測儀對樣品進行定量檢測的方法。

優(yōu)勢：

生物樣本中沒有磁性材料，沒有本底干擾；

磁信號可以傳過NC膜，可以檢測整個條帶的磁信號。