蛋白濃縮和換 Buffer 通常使用的超濾管，可重復(fù)使用，使用一次就扔掉太浪 費(fèi)。常用 Millipore 的 Amicon-Ultra-15 超濾管（MWCO10kD） 。也有其它型號(hào) 的、 不同體積大小和 MWCO 超濾管可選，視目的蛋白的分子量與濃縮前體積、濃縮 目標(biāo)體積而定。以下是個(gè)人總結(jié)的使用方 法和注意事項(xiàng)。

1、選擇合適的超濾管，主要考慮 MWCO 和濃縮體積，常見(jiàn)的是 Ultra-15 （10kD） 。到底選擇多大截留分子量比較合適呢？10kDa、 5kDa、還是 30kDa？ 通常應(yīng)截留分子量不應(yīng)大于目的蛋白分子量的 1/3 ，比如目的蛋白分子量為 35kDa，就可以選擇 10kDa 截留分子量的超濾管。若目的蛋白分子量為 10kD 左 右，則可以用截留分子量 3kD 的超濾管。認(rèn)真閱讀使用說(shuō)明書(shū)，注意超濾膜對(duì) 各種化學(xué)物質(zhì)的耐受程度有所不同，表格中有。

2、新買來(lái)的超濾是干燥的，使用前加入 MilliQ 水，水量*過(guò)膜，冰浴或冰 箱里預(yù)冷幾分鐘。然后將水倒出，即可加入蛋白液，加入的多少，以不超過(guò)管頂 的白線為準(zhǔn)。操作要輕，加入蛋白液前，超濾管需要插在冰上預(yù)冷。

3、平衡。質(zhì)量和重心二者都要達(dá)到平衡。注意轉(zhuǎn)速和加速度不可太快，否則 直接損壞超濾膜。開(kāi)始離心超濾（離心機(jī)預(yù)冷至 4 度） 。不同離心機(jī)的轉(zhuǎn)速 rpm 換算成 g 之后，有所不同。具體可參閱附件里的說(shuō)明書(shū)。離心機(jī)的加速度調(diào)至 低檔， 減小對(duì)膜的壓力。 注意， 一定要等離心機(jī)達(dá)到目的轉(zhuǎn)速之后， 方可離開(kāi) 離 心機(jī)，否則離心機(jī)出問(wèn)題時(shí)，無(wú)法時(shí)間處理，后果不可預(yù)測(cè)！膜與轉(zhuǎn)軸的方 向根據(jù)說(shuō)明書(shū)調(diào)整（角轉(zhuǎn)離心機(jī)的情況是膜與軸垂直） 。在實(shí)際使用中，一般轉(zhuǎn) 速 開(kāi)的比說(shuō)明書(shū)里的要低，這樣可以延長(zhǎng)離心管的使用壽命。

4、當(dāng)濃縮到剩下 1ml 時(shí)， 【取 50ul 國(guó)產(chǎn) Bradford 溶液，加入 10ul 流穿，看有 沒(méi)變藍(lán)色，以此判斷超濾管是否漏掉蛋白。如果管漏了，將上層和流穿重新倒入 新管中開(kāi)始超濾。要判斷是否漏管，用 5mgml 的 BSA 離心 10min，再取流 穿，跑蛋白膠或 Bradford 粗測(cè)】 ，繼續(xù)加入剩下的蛋白液濃縮（在冰上操作，防 止蛋白受熱） ， 直到所有濃縮液都加完為止。離心過(guò)程中注意是否發(fā)生蛋白沉淀， 導(dǎo)致堵管。若發(fā)生沉淀，要確定沉淀的具體原因，是蛋白濃度過(guò)高還是 Buffer 不合適；前者可用多根超濾管同時(shí)超濾，降低濃度的辦法解決，后者的方法是換 不同的 Buffer，直到蛋白不發(fā)生沉淀為 止。

5、前面幾步用以濃縮蛋白，如果要換 Buffer，在總蛋白液濃縮至 1ml 左右的 時(shí)候，輕輕加入新的 Buffer（經(jīng) 0.22um 超濾膜超濾） ，再 濃縮至 1ml 左右，連續(xù) 三次，后一次的濃縮終體積根據(jù)需要的蛋白濃度而定，一般不多于 500ul，也 有濃縮至 200ul 以內(nèi)的情況。按照每次至少 10 倍 左右的體積濃縮算，三次達(dá)到 1000 倍以上，基本上可以達(dá)到換 buffer 的目的。

6、取出終蛋白濃縮液的操作在冰上操作，用黃槍頭（200ul）取，輕輕順著 邊緣插入槍頭，輕輕吹打、混勻蛋白液，注意不要碰到超濾膜，然后吸取 濃縮 液，每次吸接近 200ul，直到吸完。管底剩下的后一點(diǎn)濃縮液不必吸取，否則 難度太大，有可能損壞超濾膜。后加入 MilliQ 水到超濾管中，沒(méi)過(guò) 超濾膜， 防止膜失水變干。

7、以下是處理超濾管，重復(fù)利用超濾管的步驟。

8、 倒出超濾管里的水， 用 milliQ 水輕輕潤(rùn)洗幾次， 【若管底有可見(jiàn)的蛋白沉淀， 可以先加入水， 然后用槍頭吹打， 注意不要碰到膜， 吹打至沉淀懸起， 然后倒掉， 不可用自來(lái)水猛沖】然后加入 0.2M 的 NaOH 溶液，室溫放置 20min，期間平衡 超濾管。再離心 10min。倒出殘留的 NaOH 溶液，將 管芯浸入 MilliQ 水的燒杯 (1 或 2L)中,放置幾個(gè)小時(shí),再換新的水,放置幾個(gè)小時(shí)， 不斷稀釋 NaOH 濃度。 50ml 管和蓋子用自來(lái)水洗，內(nèi)壁再用 MilliQ 水洗干凈。

9、取出浸沒(méi)的管芯，加至接近滿的 MilliQ 水，50ml 管也加滿 MilliQ 水，將管 芯慢慢放入 50ml 離心管，排出部分水，然后蓋上蓋子，放 4 度保存，直到下次 使用。一般來(lái)說(shuō)，按照上述步驟和注意事項(xiàng)，每根管用三四年不會(huì)壞。