基因組DNA和質(zhì)粒DNA的分離和定量注意事項(xiàng)

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本部分介紹從不同樣本來(lái)源分離和定量基因組DNA，以及分離和定量質(zhì)粒DNA的注意事項(xiàng)。此外，本部分內(nèi)容還涉及通用的質(zhì)粒DNA處理操作，包括如何制備和轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，如何培養(yǎng)和處理含有質(zhì)粒的細(xì)胞，以及一些基因組DNA分析通用的技術(shù)。

何為DNA？

基因組DNA

基因組DNA構(gòu)成了生物體的完整遺傳信息。幾乎所有生物體的基因組組成都是DNA，僅有的例外是具有RNA基因組的部分病毒。基因組DNA分子通常較大，且在多數(shù)生物體中是以DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物（即所謂的染色體）的存在。不同生物體的染色體的尺寸、數(shù)量，以及基因組DNA的性質(zhì)各異。病毒DNA基因組相對(duì)較小，可以為單戀或雙鏈，線狀或循環(huán)狀。所有其它生物體的基因組都是雙鏈DNA形式。細(xì)菌具有單個(gè)循環(huán)狀的染色體。在真核生物體內(nèi)，多數(shù)基因組DNA位于細(xì)胞核內(nèi)（核內(nèi)DNA），構(gòu)成多條不同尺寸的線狀染色體。此外，在真核細(xì)胞的線粒體內(nèi)，以及植物和低等真核生物的葉綠體內(nèi)，也額外含有基因組DNA。這一類DNA通常為環(huán)狀分子，以這些細(xì)胞器內(nèi)的多拷貝形式存在。

基因組DNA含有基因，即對(duì)蛋白質(zhì)或RNA進(jìn)行編碼的不連續(xù)區(qū)域?；虬幋aDNA序列，以及控制基因表達(dá)的相關(guān)調(diào)控元件。真核基因還含有稱為內(nèi)含子的非編碼區(qū)域。不同生物體的基因數(shù)量存在很大差異。編碼DNA僅占真核生物基因組DNA的一小部分：大量的DNA是不編碼的，其中的多數(shù)由重復(fù)序列構(gòu)成。部分不編碼DNA具有結(jié)構(gòu)和調(diào)控功能；但多數(shù)此類DNA的功能仍多半處于未知階段。不同生物體細(xì)胞內(nèi)每個(gè)遺傳位點(diǎn)的拷貝數(shù)目（又稱倍體摂）也存在差異。有性生殖的生物體的體細(xì)胞通常為二倍體，即具有兩套類似的染色體，因此各個(gè)遺傳位點(diǎn)也具有兩份拷貝；而生殖細(xì)胞則是單倍體，僅具有各個(gè)染色體的一份拷貝。原核細(xì)胞為單倍體。部分植物為多倍體，如現(xiàn)代小麥就是六倍體（每個(gè)染色體六份拷貝）。

質(zhì)粒DNA

細(xì)菌質(zhì)粒為雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子，大小為1 kb 到大于200 kb不等。細(xì)菌質(zhì)粒已在一系列細(xì)菌種屬中發(fā)現(xiàn)，它們是獨(dú)立于細(xì)菌染色體進(jìn)行遺傳和復(fù)制的附加遺傳單位。但想要成功轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，它們?nèi)匀灰蕾囁拗魈峁┑拿负偷鞍踪|(zhì)。

質(zhì)粒中通常含有編碼（在部分環(huán)境下）有利于宿主細(xì)胞的酶的基因。這些編碼的酶可能會(huì)參與抵制環(huán)境內(nèi)檢出的毒素（例如，復(fù)雜的有機(jī)復(fù)合物）或者細(xì)菌自身產(chǎn)生的毒素，或生成相應(yīng)的抗體。 

質(zhì)粒DNA純化后，可用于測(cè)序、PCR、蛋白表達(dá)、轉(zhuǎn)染以及基因療法等一系列下游應(yīng)用。

DNA提取技術(shù)

DNA可采用許多種方法進(jìn)行純化，但下游應(yīng)用真正決定了DNA的純化方法。除了采用自制方法（例如，CsCl離心梯度純化法）進(jìn)行分離外，許多供應(yīng)商還提供了DNA提取試劑盒。3種zui通用的DNA提取試劑盒的特征如下表所示。

陰離子交換法純化出的DNA的純度和生物活性，至少相當(dāng)于兩輪CsCl梯度純化，但用時(shí)僅相當(dāng)于后者的零頭而已。純化出的核酸具有zui高品質(zhì)的質(zhì)量，是敏感的下游生物學(xué)應(yīng)用（如轉(zhuǎn)染、顯微注射、測(cè)序和基因療法研究）的理想選擇。

二氧化硅膜技術(shù)純化出的高純度核酸適于大多數(shù)分子生物學(xué)和臨床研究應(yīng)用，如限制消化、連接、標(biāo)記、擴(kuò)增，以及放射性和熒光測(cè)序。

磁性顆粒技術(shù)純化出的高純度核酸適于臨床和獸醫(yī)研究中的大多數(shù)分子生物學(xué)應(yīng)用，如限制消化、連接、標(biāo)記、擴(kuò)增，以及放射性和熒光測(cè)序。磁性顆粒技術(shù)常常可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，以快速、經(jīng)濟(jì)地開(kāi)展核酸純化操作。

DNA研究：良好的實(shí)驗(yàn)室規(guī)范

處理DNA

DNA是一種相對(duì)穩(wěn)定的分子。但應(yīng)避免在DNA溶液中引入核酸酶，因?yàn)榇祟惷笗?huì)造成DNA降解?；蚪MDNA由超大的DNA分子構(gòu)成，因此較為脆弱，極易被破壞。為確?；蚪MDNA的完整性，應(yīng)避免進(jìn)行過(guò)多和過(guò)于粗糙的移液和渦旋振蕩操作。DNA儲(chǔ)存在水中時(shí)，極易酸性水解，因此應(yīng)將其儲(chǔ)存在TE緩沖液中，詳見(jiàn)下表。

核酸換算：DNA

DNA的分子量換算

• 雙鏈DNA分子的MW（鈉鹽） = （堿基對(duì)數(shù)目） x （662 分子量/堿基對(duì)）
• 單鏈DNA分子的MW（鈉鹽） = （堿基對(duì)數(shù)目） x （331 分子量/堿基對(duì)）
• DNA核苷酸酶的MW（鈉鹽，pH ≥7）：
• MW = (N_A x 335.2) + (N_C x 311.2) + (N_C x 351.2) + (N_T x 326.2) + P

其中N_X = 寡核苷酸內(nèi)各核苷酸殘基數(shù)目（各核苷酸列明的MW為（在相應(yīng)鈉鹽條件下）融合到寡核苷酸內(nèi)的相應(yīng)核苷酸的MW） 
對(duì)于脫磷酸化寡核苷酸：P = –84.0 
對(duì)于磷酸化寡核苷酸：P = 40.0

DNA的分子換算

DNA的分子換算請(qǐng)見(jiàn)表：微克DNA換算和皮摩爾DNA換算。蛋白質(zhì)/DNA換算請(qǐng)見(jiàn)表：蛋白質(zhì)/DNA換算。

分光光度法測(cè)定DNA濃度

DNA和RNA的濃度應(yīng)通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定260 nm (A₂₆₀)下的吸光度來(lái)測(cè)定。出于準(zhǔn)確度需要，260 nm下的吸光度讀數(shù)應(yīng)將至0.15到1.0之間。

在10 mM Tris•Cl、pH 8.5條件下，純凈的DNA的A₂₆₀/A₂₈₀比率為1.8–2.0之間。

A₂₈₀處的強(qiáng)吸光度會(huì)造成較低的A₂₆₀/A₂₈₀ 比率，這表示有蛋白質(zhì)等污染物存在。

在270 nm和275 nm處的強(qiáng)吸光度則表示存在污染物苯酚。

在325 nm處的吸光度表示很可能存在溶液或臟污的器皿造成的污染。

基因組DNA提取之前的樣本儲(chǔ)存

起始材料的質(zhì)量影響著分離的DNA的質(zhì)量和產(chǎn)量。純化來(lái)自于新鮮采集的組織和細(xì)胞的基因組DNA時(shí)，可以達(dá)到zui高的DNA產(chǎn)量和質(zhì)量。如果樣品在采集之后無(wú)法即時(shí)處理，則可將其儲(chǔ)存在可保留DNA完整度的條件下。總的來(lái)說(shuō)，如果樣品，尤其是動(dòng)物樣品，在未經(jīng)處理的情況下在2–8°C或–20°C條件下儲(chǔ)存，會(huì)造成基因組DNA的產(chǎn)量下降。此外，應(yīng)避免對(duì)凍存樣品反復(fù)凍融，因?yàn)檫@會(huì)造成基因組DNA大小變小，同時(shí)還會(huì)造成病原DNA（例如，病毒DNA）的產(chǎn)量下降。我們將在下文討論不同起始材料建議的儲(chǔ)存方法。

血液

將要儲(chǔ)存的血液樣品中應(yīng)添加抗凝劑。例如，采用肝素或EDA處理的血液樣本可在2–8°C下儲(chǔ)存數(shù)天，或在–20°C或–80°C下儲(chǔ)存數(shù)周。此外，采用ACD溶液B （0.48%檸檬酸，1.32%檸檬酸鈉，1.47%葡萄糖；每6 ml血液使用1 ml）處理的血液樣本，在2–8°C下至少可儲(chǔ)存5天，在–20°C下至少可儲(chǔ)存1個(gè)月。如需儲(chǔ)存，可準(zhǔn)備血液細(xì)胞核，并在–20°C下儲(chǔ)存。

其它臨床樣本

大多數(shù)生物液（例如，血漿、血清和尿液）和糞便樣本可在2–8°C下儲(chǔ)存數(shù)小時(shí)。如需儲(chǔ)存，建議在–20°C或–80°C下冰凍。拭子可在室溫下干燥儲(chǔ)存。

福爾馬林固定、石蠟包埋(FFPE)是另一種樣本儲(chǔ)存方法，尤其適用于臨床組織樣品。根據(jù)組織類型，生物分子在收集后發(fā)生分解、誘導(dǎo)或改性的速度存在差異。因此，組織切除和固定的操作步驟應(yīng)盡可能簡(jiǎn)短、快捷。

組織的固定涉及將樣本放入福爾馬林溶液的步驟，而后者的組分則存在各種差異（常用的10%福爾馬林溶液含有3.7%的甲醛和1–1.5%的甲醇）。由此引發(fā)的化學(xué)反應(yīng)導(dǎo)致生物分子之間發(fā)生交聯(lián)，包括核酸之間、蛋白質(zhì)之間以及核算和蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)。為獲得*的固定結(jié)果，應(yīng)采用中性緩沖的福爾馬林溶液，而非未緩沖或酸性的福爾馬林溶液。中性緩沖液可減緩福爾馬林的降解，目前可以確信的是后者降解的產(chǎn)物會(huì)對(duì)核酸質(zhì)量造成一定程度的破壞。

為確保*的固定效果，福爾馬林和組織的體積比應(yīng)至少達(dá)到10:1。在處理較小的組織樣本（如針穿刺吸取組織活檢樣本）時(shí)，這一目標(biāo)很容易實(shí)現(xiàn)。但在處理體積較大的組織樣本時(shí)，用于組織固定的福爾馬林溶液則可能會(huì)出現(xiàn)不足。在此情況下，應(yīng)將組織切片之后再進(jìn)行福爾馬林固定。為避免過(guò)度固定(overfixation)，組織固定時(shí)間應(yīng)不超過(guò)24小時(shí)。

經(jīng)過(guò)福爾馬林固定后，組織樣本將要包埋在石蠟中，這一過(guò)程包括幾步。*步脫水，即采用酒精（通常為乙醇）取代水。接下來(lái)兩步為：透明，即采用二甲苯和二甲苯替代物取代酒精；浸蠟：即用石蠟取代二甲苯。zui后一步是包埋，即整個(gè)組織用石蠟包裹起來(lái)。在浸蠟之前，確保組織樣本已*脫水非常重要，因?yàn)闅埩舻乃謺?huì)造成樣本降解。為避免酒精和二甲苯因之前使用而可能攜帶水分，建議始終采用新鮮的酒精和二甲苯。為確保自FFPE樣本恢復(fù)可用的DNA時(shí)能獲得*恢復(fù)效果，應(yīng)采用較低的解凍溫度解凍石蠟。此外，應(yīng)避免采用含有蜂蠟等添加劑的石蠟，因?yàn)檫@一類添加劑可能會(huì)干擾生物分子的恢復(fù)。

動(dòng)物組織

新鮮采集的組織可以立即冰凍，并在–20°C、–80°C下，或者液氮中儲(chǔ)存。裂解的組織樣本可在室溫下，在適宜的裂解液中儲(chǔ)存數(shù)月。

動(dòng)物和人體組織也可固定儲(chǔ)存。我們建議您采用酒精和福爾馬林等固定劑；但如果組織在福爾馬林中儲(chǔ)存，會(huì)導(dǎo)致DNA出現(xiàn)化學(xué)修飾。如果需要從組織中分離DNA，建議不要采用可能會(huì)引起交聯(lián)反應(yīng)的固定劑，如鋨酸。此外，還可從石蠟包埋的組織中分離DNA。

動(dòng)物、酵母和細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)

離心處理采集的細(xì)胞培養(yǎng)液，吸棄上清液，然后在–20°C或–80°C下儲(chǔ)存細(xì)胞。此外，還可準(zhǔn)備動(dòng)物細(xì)胞核并在–20°C下儲(chǔ)存。

植物組織

在不影響DNA質(zhì)量或產(chǎn)量的前提下，大多數(shù)植物屬的新鮮葉子和針葉zui多可在4°C下儲(chǔ)存24小時(shí)。通常意義上講，如果樣本計(jì)劃的儲(chǔ)存時(shí)間超出24小時(shí)，則應(yīng)在–80°C下儲(chǔ)存。即便如此，仍有部分樣本（如樹(shù)芽）可在4°C下儲(chǔ)存數(shù)天。組織在4°C下儲(chǔ)存時(shí)，為避免脫水，應(yīng)避免在密閉的容器內(nèi)儲(chǔ)存。較大的樣本（如，樹(shù)枝）則可儲(chǔ)存在含有一塊濕潤(rùn)的紙巾的塑料袋中。

如果凍存樣本的方法不符合實(shí)際情況，則可采用大量方法干燥植物組織，例如硅膠、食品脫水劑或凍干機(jī)(3)。為防止DNA降解，應(yīng)至少在24小時(shí)內(nèi)使材料*干燥。如需儲(chǔ)存，干燥后的樣本應(yīng)在黑暗、室溫、干燥或氣密條件下儲(chǔ)存。根據(jù)樣本的處理方式，植物標(biāo)本和法醫(yī)學(xué)樣本中的DNA可能會(huì)存在不同程度的降解。破碎過(guò)的植物材料可在室溫下，在適宜的裂解液中儲(chǔ)存數(shù)月。

真菌材料

菌絲應(yīng)直接從培養(yǎng)皿或液體培養(yǎng)液中采集。如從液體培養(yǎng)液中采集，在進(jìn)行DNA分離和儲(chǔ)存前，應(yīng)采用離心法沉淀細(xì)胞，并吸棄上清液。采集的樣本可以直接冷凍或凍干，并在–80°C下儲(chǔ)存。

基因組DNA提取前的樣本破碎

進(jìn)行所有的基因組DNA分離步驟前，必須要進(jìn)行*的細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)膜以及細(xì)胞器的破碎和裂解。破碎不*，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)量大幅度減少。

破碎方法

裂解液

破碎通常包括含有去污劑（用于破壞細(xì)胞膜）和蛋白酶（用于消化蛋白細(xì)胞成分）裂解液的應(yīng)用。所選的蛋白酶取決于所用的裂解液。為有效裂解，部分樣本需要采取額外處理。

使用轉(zhuǎn)子-定子勻漿機(jī)破碎

根據(jù)的樣本粗燥程度，轉(zhuǎn)子-定子勻漿機(jī)可在5–90秒內(nèi)將動(dòng)物和植物組織*破碎。轉(zhuǎn)子以*的轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)，以湍流和機(jī)械式剪切組合作用使樣本破碎。應(yīng)選用尺寸適當(dāng)?shù)娜萜鳎３謩驖{器探頭浸入，同時(shí)將浸入的探頭置于離心管的一側(cè)，從而將樣本的泡沫量降至zui小。定子-轉(zhuǎn)子勻漿機(jī)現(xiàn)具有不同的尺寸規(guī)格，可采用不同規(guī)格的探頭。直徑為5 mm和7 mm的探頭適用于體積不超過(guò)300 µl的應(yīng)用，可在微量離心管中勻漿。直徑為10 mm或更高的探頭則需要更大的離心管。

使用研磨機(jī)破碎

采用研磨機(jī)破碎時(shí)，樣本將在存在研磨珠的情況下高速攪拌。研磨珠與樣本不斷碰撞過(guò)程中，剪切并粉碎樣本，同時(shí)進(jìn)行破碎。破碎效果受以下因素影響：

• 研磨珠的大小和成分
• 緩沖液和研磨珠的比率 
• 起始材料的量
• 攪拌器的轉(zhuǎn)速和配置
• 崩解時(shí)間 

細(xì)菌zui適宜采用的研磨珠為0.1 mm（平均直徑）的玻璃珠，酵母和單細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞zui適宜采用的是0.5 mm的玻璃珠，動(dòng)物組織zui適宜采用的是3–7 mm的不銹鋼珠，植物和真菌組織zui適宜采用的是3–7 mm的不銹鋼柱或或碳化鎢珠。必須要采用高濃度硝酸對(duì)玻璃珠進(jìn)行洗滌預(yù)處理。此外，也可采用市售的酸洗過(guò)的玻璃珠子。所有其它破碎參數(shù)則必須根據(jù)各種應(yīng)用，依照經(jīng)驗(yàn)確定。

采用研磨皿和研磨棒破碎

如要用傳統(tǒng)研磨皿和研磨棒進(jìn)行破碎，則應(yīng)用液氮即時(shí)冰凍樣品，并在液氮環(huán)境下研磨成細(xì)末。將上清液（組織粉末和液氮）移到液氮冷卻的適宜尺寸的試管中，在樣本不融解的情況下讓液氮蒸發(fā)。添加裂解液，然后盡可能快速地進(jìn)入分離操作。

從不同樣本源分離基因組DNA的特別注意事項(xiàng)

部分樣本源中含有可導(dǎo)致DNA分離和分析過(guò)程出現(xiàn)問(wèn)題的物質(zhì)。在處理此類樣本源時(shí)，需要采取特別注意事項(xiàng)。本部分將討論處理一系列樣本源時(shí)的注意事項(xiàng)。

血液

我們會(huì)定期采集人類血液樣本以供臨床分析應(yīng)用。血液中含有大量可能干擾下游DNA分析的酶抑制劑。此外，諸如肝素和EDTA等通用抗凝劑還會(huì)干擾下游檢測(cè)。從血液中分離DNA時(shí)，需要具備可提供不含污染物和酶抑制劑的DNA的方法。

在動(dòng)物體內(nèi)，鳥(niǎo)類、魚(yú)、青蛙的紅細(xì)胞（紅血細(xì)胞）含有核酸，因而也含有基因組DNA，而哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞中則不含這些成分。由于健康的哺乳動(dòng)物血液中所含的紅細(xì)胞要比含有核酸的白細(xì)胞（白血細(xì)胞，包括淋巴細(xì)胞、單核白細(xì)胞和顆粒性白細(xì)胞）數(shù)量超出近1000倍，在DNA分離之前去除紅細(xì)胞可提高DNA產(chǎn)量。為此可結(jié)合采用幾種方法。其中的一種方法是選擇性溶解紅細(xì)胞：在低滲緩沖液條件下，紅細(xì)胞要比白細(xì)胞更易低滲休克和快速破裂。另一種方法是Ficoll密度梯度離心法，可回收單核細(xì)胞（淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞）并去除紅細(xì)胞。此技術(shù)還可去除粒細(xì)胞。第三種方法則是通過(guò)在室溫下對(duì)全血進(jìn)行3300 x g離心10分鐘，制備全血白細(xì)胞富集級(jí)分（即所謂的白細(xì)胞層）。離心之后，會(huì)分成三層：上清層為質(zhì)粒；中間層為白細(xì)胞層；底層含有濃縮的紅細(xì)胞。

血液樣本，包括哪些經(jīng)過(guò)紅細(xì)胞去除處理的血液樣本，可采用裂解液和蛋白酶或蛋白酶K有效裂解。除動(dòng)物基因組DNA外，也可從血液樣本中分離病毒和細(xì)菌DNA。

其它臨床樣本

進(jìn)行DNA分離時(shí)，多數(shù)生物液可采用與血液樣本相同的方式進(jìn)行處理。從糞便樣本中分離DNA較為困難，這是因?yàn)榧S便中通常含有很多可能降解DNA、抑制下游酶反應(yīng)的成分。

動(dòng)物組織和細(xì)胞培養(yǎng)液

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液和多數(shù)動(dòng)物組織可采用裂解液和蛋白酶或蛋白酶K有效裂解。為幫助裂解，新鮮或凍存的樣本應(yīng)切成小塊。在裂解前使用勻質(zhì)機(jī)或磨皿和研磨棒進(jìn)行機(jī)械破碎，可縮短裂解時(shí)間。骼肌肉、心臟和皮膚組織中含有豐富的收縮蛋白、結(jié)締組織和膠原蛋白，為確保能采用蛋白酶或蛋白酶K進(jìn)行完整消化，在處理這一類組織時(shí)要格外小心。

對(duì)于固定后的組織，在裂解前應(yīng)去除固定劑。通過(guò)用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌組織，可去除福爾馬林成分。從石蠟包埋的組織中去除石蠟的方法與此類似，即先采用二甲苯提取，然后采用酒精洗滌。

酵母細(xì)胞培養(yǎng)液

為消化細(xì)胞壁，酵母細(xì)胞培養(yǎng)液必須先用溶壁酶或酵母裂解酶進(jìn)行處理。處理后的去壁酵母細(xì)胞將采用離心法進(jìn)行收集，然后使用裂解液和蛋白酶K或蛋白酶進(jìn)行裂解。

細(xì)菌DNA

很多細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)液可采用裂解液和蛋白酶或蛋白酶K有效裂解。部分細(xì)菌，尤其是革蘭氏陽(yáng)性菌，則需要采用特殊的酶（例如溶菌酶或溶葡萄球菌酶）進(jìn)行預(yù)孵育以裂解牢固堅(jiān)固的多層細(xì)胞壁。

從大量的臨床樣本中，也可分離出細(xì)菌DNA。細(xì)菌細(xì)胞應(yīng)從生物液中沉淀下來(lái)，并從細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)液中分離DNA。在進(jìn)行細(xì)菌細(xì)胞離心之前，拭子樣本應(yīng)采用殺真菌劑進(jìn)行預(yù)處理。

DNA病毒

在臨床應(yīng)用中，病毒DNA通常（當(dāng)然不是全部）分離自無(wú)細(xì)胞的體液，數(shù)量非常少。在通過(guò)超速離心、超濾或沉淀法DNA分離之前，可能需要對(duì)病毒微粒進(jìn)行濃縮處理。如果預(yù)期DNA產(chǎn)量非常低時(shí)，在DNA分離過(guò)程中，可能還必須要添加載體DNA。制備整合的病毒DNA時(shí)，采取的操作步驟與從相關(guān)樣本中分離基因組DNA的步驟相同。諸如M13和lambda這一類的噬菌體，分離自感染的培養(yǎng)液。在分離病毒DNA之前，必須通過(guò)離心方法從培養(yǎng)液中去除細(xì)菌細(xì)胞。

植物

從植物材料中分離DNA時(shí)面臨著特殊的挑戰(zhàn)，通用的技術(shù)往往需要適當(dāng)調(diào)整之后才能用于處理植物樣本。部分植物代謝物具有類似于核酸的化學(xué)性質(zhì)，難以從DNA制備物中去除。純化操作引入的共純化代謝物和污染物（如鹽或苯酚）可能抑制酶促反應(yīng)或造成分光光度法測(cè)定偏差和凝膠移位。

采用在不會(huì)誘發(fā)高水平植物代謝的條件下生長(zhǎng)的植物，通?？梢愿纳艱NA分離效果。由于植物之間存在巨大的差異，很難籠統(tǒng)地說(shuō)明適宜采用的生長(zhǎng)條件。但仍有一個(gè)基本適用的準(zhǔn)則，即在條件允許的情況下，盡量使用健康、年輕的組織。年輕組織的DNA產(chǎn)量通常要高于年老的組織，這是因?yàn)槟贻p組織所含的細(xì)胞數(shù)量通常要多過(guò)同等數(shù)量的年老組織。此外，同等重量條件下，年輕組織的代謝量也更少。除此之外，很多“自制”DNA分離方法實(shí)驗(yàn)方案建議在采集前，先使植物在黑暗環(huán)境下生長(zhǎng)1–2天，以防止積累較高水平的植物代謝物。

DNA處理：良好的實(shí)驗(yàn)室規(guī)范

大腸桿菌（E. coli）株系的生長(zhǎng)

良好的微生物學(xué)技術(shù)總是有助于確保*的質(zhì)粒DNA產(chǎn)量和質(zhì)量。為在您的質(zhì)粒制備過(guò)程中制備出的細(xì)菌培養(yǎng)液，需遵循以下步驟。

1. 通過(guò)將來(lái)自于新鮮的劃線篩選培養(yǎng)皿中的單個(gè)菌落接種到2–10 ml含有適當(dāng)?shù)目股氐腖B培養(yǎng)基中，制備酵母劑。充分振蕩的(~300 rpm)的情況下，在37°C下生長(zhǎng)約8小時(shí)。
   小貼士：請(qǐng)勿從已儲(chǔ)存較長(zhǎng)時(shí)間的甘油菌原液、瓊脂穿刺培養(yǎng)液或培養(yǎng)皿上直接接種，因?yàn)檫@會(huì)造成質(zhì)粒損失或突變。
   小貼士：通?？梢栽诋?dāng)天方便地生長(zhǎng)發(fā)酵劑，以便在次日早晨收集過(guò)夜生長(zhǎng)的較大的培養(yǎng)物。
2. 按照適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒純化實(shí)驗(yàn)方案，將發(fā)酵劑按照1/500到1/1000的比例稀釋到較大體積的篩選LB培養(yǎng)基中。
   為確保充分通風(fēng)，應(yīng)采用容量至少為培養(yǎng)物體積4倍的燒瓶。請(qǐng)勿使培養(yǎng)物的體積超出了實(shí)驗(yàn)方案建議的體積，否則會(huì)造成裂解不充分，降低制備物質(zhì)量。 
3. 在充分振蕩(~300 rpm)的情況下，讓培養(yǎng)物在37°C下生長(zhǎng)12–16小時(shí)（參見(jiàn)下一部分說(shuō)明）。 
4. 接種12–16小時(shí)后，采集細(xì)菌培養(yǎng)液。這一時(shí)刻對(duì)應(yīng)于從對(duì)數(shù)生到靜止生產(chǎn)期的過(guò)渡階段，此時(shí)細(xì)胞密度較高(3–4 x 10⁹/ml)且細(xì)胞內(nèi)的RNA含量較低。如過(guò)早采集，由于細(xì)胞密度相對(duì)較低，會(huì)造成質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量低于預(yù)期。如過(guò)晚采集，培養(yǎng)液會(huì)因過(guò)于老化而造成DNA降解，從而使質(zhì)粒的質(zhì)量和產(chǎn)量都較低。
   小貼士：培養(yǎng)物的生長(zhǎng)依賴于若干因素，如宿主株系、質(zhì)粒插入和拷貝數(shù)以及培養(yǎng)基等等。為確定某個(gè)體系的*采集時(shí)間，應(yīng)通過(guò)測(cè)定OD₆₀₀（參見(jiàn)下一部分說(shuō)明）來(lái)監(jiān)測(cè)細(xì)胞密度和培養(yǎng)物生長(zhǎng)情況。
5. 采集細(xì)菌培養(yǎng)物時(shí)，應(yīng)在4°C下以6000 x g 的速度離心15分鐘。將敞開(kāi)的離心管倒置，去除所有痕量的上清液，直至培養(yǎng)基已全部倒出。此時(shí)余下的細(xì)胞即可遵照適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒純化實(shí)驗(yàn)方案，進(jìn)行裂解操作處理。 
   此外，也可在此時(shí)暫停裂解操作處理，將離心獲得的細(xì)胞沉淀冷凍保存，之后再進(jìn)行裂解操作。冷凍的細(xì)胞沉淀可在–20°C下保存數(shù)周。

大腸桿菌(E. coli)生長(zhǎng)曲線

大腸桿菌(E. coli)培養(yǎng)液的生長(zhǎng)曲線可分為幾個(gè)階段。*階段，遲緩期(lag phase)，直接發(fā)生在將發(fā)酵劑接種到新鮮培養(yǎng)基中之后。在這一階段，由于細(xì)菌仍在適應(yīng)新鮮培養(yǎng)基，細(xì)胞分裂比較緩慢。之后細(xì)菌開(kāi)始更快速地分裂，培養(yǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)期(logarithmic (log) phase)（接種之后4–5小時(shí)），在這一階段細(xì)胞數(shù)量呈指數(shù)增長(zhǎng)。隨著時(shí)間推移，培養(yǎng)基內(nèi)可用的營(yíng)養(yǎng)物逐漸被消耗，而細(xì)菌釋放的代謝物還會(huì)細(xì)菌生長(zhǎng)，培養(yǎng)變?yōu)轱柡蜖顟B(tài)，進(jìn)入穩(wěn)定期(stationary phase)（接種后約16小時(shí)），在這一階段細(xì)胞密度保持恒定。zui后，隨著細(xì)胞開(kāi)始裂解，活性細(xì)菌細(xì)胞的數(shù)量開(kāi)始下降，DNA出現(xiàn)部分降解，培養(yǎng)進(jìn)入衰亡期(decline phase)。

大腸桿菌（E. coli）的保存

根據(jù)預(yù)期的儲(chǔ)存時(shí)間，可有多種方法儲(chǔ)存大腸桿菌(E. coli)。甘油菌原液和穿刺培養(yǎng)液均可支持細(xì)菌儲(chǔ)存，而瓊脂盤(pán)則適于短期儲(chǔ)存。各種方法的準(zhǔn)備說(shuō)明和有益貼士請(qǐng)見(jiàn)下文所述。

甘油原液

大腸桿菌（E. coli）株系可在–70°C下，在15%的甘油原液中儲(chǔ)存數(shù)年。

細(xì)菌甘油原液的制備方法如下：

1. 向2 ml螺旋小瓶中加入0.15 ml甘油(99%)，然后采用高壓滅菌法進(jìn)行滅菌。 
   小貼士：儲(chǔ)存滅菌甘油的小瓶可分批準(zhǔn)備，并在室溫下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/li>
2. 向盛放預(yù)先滅菌的甘油的小瓶中添加0.85 ml對(duì)數(shù)期的大腸桿菌(E. coli)培養(yǎng)液。
3. 充分渦旋振蕩小管，確保細(xì)菌培養(yǎng)液和甘油均勻混合。
4. 冰凍在酒精-干冰浴或液氮中，并在–70°C下儲(chǔ)存。 
   小貼士：請(qǐng)勿反復(fù)凍融甘油原液，否則會(huì)降低細(xì)菌活性。
   小貼士：對(duì)于較為珍貴的株系，建議分2個(gè)原液瓶?jī)?chǔ)存。
   小貼士：從儲(chǔ)存的株系恢復(fù)時(shí)，建議在篩選培養(yǎng)平板上對(duì)株系劃線，以檢查抗生素標(biāo)記。

穿刺培養(yǎng)液

大腸桿菌(E. coli)株系還可以穿刺在半固態(tài)瓊脂糖中儲(chǔ)存至多1年。穿刺培養(yǎng)用于在實(shí)驗(yàn)室間運(yùn)輸和遞送細(xì)菌株系。

穿刺培養(yǎng)液的準(zhǔn)備方法如下：

1. 準(zhǔn)備并高壓滅菌LB瓊脂糖（含有0.7%瓊脂糖的標(biāo)準(zhǔn)LB培養(yǎng)基）。
2. 將LB瓊脂糖冷卻到50°C以下（手握的時(shí)候感覺(jué)到溫度適宜），然后添加適當(dāng)?shù)目股亍Ｔ诃傊侨蕴幱谝簯B(tài)時(shí)，在無(wú)菌條件下向2 ml螺口小瓶中添加1 ml瓊脂糖，然后等待其凝固。
3. 瓊脂糖小瓶可分批準(zhǔn)備，并在室溫下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/li>
4. 采用滅菌直絲，從新鮮滅菌培養(yǎng)盤(pán)中挑起一片菌落，在半固態(tài)瓊脂糖深入穿刺幾次。
5. 保持瓶帽稍稍松動(dòng)，將小瓶在37°C下孵育8–12小時(shí)。
6. 牢牢地密封上小瓶，在黑暗條件下儲(chǔ)存，理想的儲(chǔ)存溫度為4°C。
7. 從儲(chǔ)存的株系恢復(fù)時(shí)，建議在篩選培養(yǎng)平板上對(duì)株系劃線，以檢查抗生素標(biāo)記。

瓊脂平板

劃線的細(xì)菌平板可采用石蠟密封，在4°C下倒置儲(chǔ)存數(shù)周。為確保篩選標(biāo)記不會(huì)丟失，務(wù)必再含有適當(dāng)抗生素的平板上進(jìn)行細(xì)菌劃線。

為獲得分離效果良好的菌落，請(qǐng)按如下所述在瓊脂平板上劃線：

1. 用火焰烘烤絲環(huán)，然后在空余的無(wú)菌瓊脂平板上冷卻。
2. 使用一根絲環(huán)，跨過(guò)新鮮的瓊脂平板一角在細(xì)菌培養(yǎng)液（來(lái)自于甘油原液、穿刺培養(yǎng)物或另一平板上的單個(gè)菌落）上劃線。 
3. 再次在火焰上烘烤絲環(huán)并冷卻。使其穿過(guò)*條劃線，然后再次跨過(guò)平板的另一角劃線。
4. 重復(fù)上述步驟直至形成某種圖案。
5. 在37°C下倒置孵育12–24小時(shí)，直至菌落開(kāi)始發(fā)育。

從細(xì)菌原液產(chǎn)出液體培養(yǎng)基

圖所示為從儲(chǔ)存的細(xì)菌原液獲得進(jìn)行質(zhì)粒分離的液體培養(yǎng)液必須采取的步驟順序。在使用前，務(wù)必要在篩選平板上對(duì)細(xì)菌原液進(jìn)行劃線，以檢查確認(rèn)它們適宜生長(zhǎng)攜帶有適當(dāng)抗生素抗性的健康菌落。此類原液中可能會(huì)含有制備所用培養(yǎng)液引起的突變，或在儲(chǔ)存過(guò)程中可能會(huì)品質(zhì)下降。

孵育的液體培養(yǎng)液應(yīng)來(lái)自于健康、分離效果良好的菌落，此類菌落采集自新鮮劃線的篩選平板。這一處理可確保培養(yǎng)液內(nèi)生長(zhǎng)的細(xì)胞均出自單個(gè)基細(xì)胞(founder cell)，具有相同的遺傳組成。

小貼士：體積>10 ml的培養(yǎng)液不可直接自平板孵育，而是應(yīng)該由2–5 ml的預(yù)培養(yǎng)液稀釋1/500到1/1000而得。

質(zhì)粒規(guī)格

根據(jù)質(zhì)粒所含的，決定著控制條件嚴(yán)格還是寬松的復(fù)制原，質(zhì)粒在拷貝數(shù)方面存在很大的差異（參見(jiàn)下表），同時(shí)質(zhì)粒的大小和相關(guān)的插入也存在很大的差異。部分質(zhì)粒，如pUC系列和衍生物，含有可導(dǎo)致自身在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)具有*的拷貝數(shù)的突變?；趐BR322的質(zhì)粒和很多柯斯質(zhì)粒通常能夠維持在較低的拷貝數(shù)。而體積極大的質(zhì)粒，在每個(gè)細(xì)胞內(nèi)通常都維持極低的拷貝數(shù)。

細(xì)菌培養(yǎng)基和抗生素

液體培養(yǎng)基

大腸桿菌（E. coli）的液態(tài)培養(yǎng)液通常可在LB (Luria-Bertani)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。但請(qǐng)注意，通常使用的LB培養(yǎng)基有很多種，成分也存在差異。不同的配方含有不同的NaCl濃度，可導(dǎo)致不同的質(zhì)粒DNA產(chǎn)量。為獲得zui高的質(zhì)粒DNA產(chǎn)量，我們建議使用表LB培養(yǎng)基中LB組分。

如需配制1升LB培養(yǎng)基，需向950 ml蒸餾水或去離子水中添加10 g NaCl、10 g 胰蛋白胨以及5 g酵母粉，然后振蕩、攪拌至*溶解。用5 M NaOH將pH調(diào)整至7.0。用蒸餾水或去離子水調(diào)配溶液體積至1升。等分成小份并高壓滅菌。

小貼士：為避免整個(gè)批次集體受到污染，建議在多個(gè)小瓶?jī)?nèi)對(duì)液態(tài)培養(yǎng)基滅菌，不要在較大的容器內(nèi)集中滅菌。高壓滅菌后，請(qǐng)勿在24小時(shí)內(nèi)使用培養(yǎng)基，以確保其已正確滅菌，不含污染微生物。

小貼士：從已經(jīng)過(guò)過(guò)濾除菌、等分成小份并在–20°C黑暗條件下儲(chǔ)存的抗生素原液中取出的抗生素，應(yīng)在使用前立即加入到液態(tài)培養(yǎng)基中。

培養(yǎng)基滅菌

依照培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)基瓶子尺寸和高壓滅菌類型適宜的壓力和滅菌時(shí)間，對(duì)液態(tài)或固態(tài)培養(yǎng)基滅菌。

小貼士：為避免培養(yǎng)基在高溫下沸騰，在高壓滅菌前，應(yīng)在瓶子中注入3/4體積的培養(yǎng)基，同時(shí)保持瓶蓋松動(dòng)。一旦培養(yǎng)基冷卻（降至40°C以下），立即擰緊瓶蓋，讓其*滅菌。

小貼士：抗生素和氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)將在高壓滅菌器的高溫下滅活。它們應(yīng)通過(guò)孔隙為0.2 µm的過(guò)濾裝置過(guò)濾滅菌，之后再添加到從妥善儲(chǔ)存的原液中取出后的已冷卻、高壓滅菌的培養(yǎng)基中。

固體培養(yǎng)基

E. coli 通常在含有1.5%瓊脂糖和適當(dāng)抗生素的LB平板上劃線和儲(chǔ)存。

制備：依照液態(tài)培養(yǎng)基部分給定的組分配制LB培養(yǎng)基。在臨高壓滅菌前，每升中加入15 g瓊脂糖并攪拌混合。高壓滅菌之后，輕輕地渦旋培養(yǎng)基，以便將融化的瓊脂糖均勻地分散到溶液中。應(yīng)特別小心高溫液體在渦旋時(shí)出現(xiàn)沸騰。

小貼士：將高壓滅菌的瓊脂糖培養(yǎng)基冷卻到50°C以下（手握時(shí)感到溫度適宜），然后再添加對(duì)溫度敏感的抗生素和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。在傾倒前*混合，以使整個(gè)培養(yǎng)基具有均勻的濃度。

小貼士：在層流罩內(nèi)傾倒平板，如果無(wú)層流罩，則可在臨近本生燈的清潔試驗(yàn)臺(tái)面上進(jìn)行傾倒。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)90 mm細(xì)菌培養(yǎng)皿中使用30–35 ml培養(yǎng)基（每升培養(yǎng)基大約對(duì)應(yīng)于30個(gè)平板）。

傾倒過(guò)平板后，通過(guò)使用本生燈火焰在表面快速略過(guò)，去除氣泡。切勿讓火焰在某處逗留，否則可能造成平板切片內(nèi)的抗生素遭破壞。

在凝固之后或者臨使用之前，取下帽蓋并將平板立在層流罩內(nèi)1小時(shí)，直接干燥平板。此外，如果您手上沒(méi)有層流罩，則可輕微開(kāi)啟平板蓋，于37°C下在培養(yǎng)箱中干燥平板30分鐘，或蓋上蓋子在室溫下倒置放置2–3天。

小貼士：為保持對(duì)光線明暗的抗生素的活性，可將平板倒置，在4°C黑暗條件下儲(chǔ)存，或者將平板卷在鋁箔紙中。存儲(chǔ)時(shí)間請(qǐng)勿超過(guò)3個(gè)月，因?yàn)檫@會(huì)造成抗生素降解。

抗生素

對(duì)于具有抗生素篩選標(biāo)記的質(zhì)粒或基因，攜帶這些質(zhì)?；蚧虻募?xì)菌株系應(yīng)在含有篩選劑的液態(tài)或固態(tài)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。缺少抗生素篩選劑，會(huì)造成帶有遺傳標(biāo)記的質(zhì)粒丟失，并可能篩選出快速生長(zhǎng)的突變！

小貼士：通過(guò)經(jīng)過(guò)過(guò)濾滅菌的各批次液態(tài)或固態(tài)培養(yǎng)基分別制備抗生素原液，均分并在–20°C黑暗條件下儲(chǔ)存。常用抗生素建議的儲(chǔ)存和工作濃度如下表所示。

小貼士：在剛剛高壓滅菌的培養(yǎng)基中添加抗生素之前，請(qǐng)確保培養(yǎng)基已冷卻到50°C以下。

裂解細(xì)菌細(xì)胞以進(jìn)行質(zhì)粒純化

由于DNA產(chǎn)量和質(zhì)量取決于用于純化的細(xì)胞裂解產(chǎn)物質(zhì)量，在質(zhì)粒分離過(guò)程中，裂解細(xì)菌細(xì)胞是非常重要的一個(gè)步驟。

堿裂解

堿裂解是質(zhì)粒純化之前(4, 5)zui常用的細(xì)菌細(xì)胞裂解方法。堿裂解過(guò)程涉及四個(gè)基本步驟。

1. 在含有RNase A酶的Tris•Cl–EDTA緩沖液中重懸采集的細(xì)菌細(xì)胞。 
   小貼士：為確保有zui大數(shù)量的細(xì)胞暴露在裂解試劑下，請(qǐng)確保重懸充分，無(wú)細(xì)胞抱團(tuán)。 
   小貼士：如需大規(guī)模純化低拷貝數(shù)質(zhì)粒（需要使用較大體積的培養(yǎng)液），則為了提高堿裂解效率進(jìn)而提升DNA產(chǎn)量，適當(dāng)增大裂解液的體積較為有益。
2. 使用NaOH/SDS裂解細(xì)胞。十二烷基硫酸鈉(SDS)可使細(xì)胞膜的磷脂和蛋白質(zhì)成分溶解，從而使細(xì)胞成分裂解并釋放。NaOH可以滅活染色體和質(zhì)粒DNA，以及蛋白質(zhì)。RNase A酶的存在，則可確保裂解過(guò)程中，解離的胞內(nèi)RNA能夠得以消化。 
   小貼士：如果在添加了裂解液(NaOH/SDS)之后，溶液變得非常粘稠、難以攪拌，則表示溶解步驟中存在過(guò)多的生物量。這會(huì)造成細(xì)胞裂解不充分，建議將所用的裂解液和中和液量加倍。 
   小貼士：注意避免劇烈地?cái)噭?dòng)或渦旋振蕩裂解液，因?yàn)檫@會(huì)對(duì)細(xì)菌染色體造成剪切作用，進(jìn)而與質(zhì)粒DNA共純化。應(yīng)輕輕地，而非將裂解試管倒置的方式攪動(dòng)溶液，反復(fù)4–6次。 
   小貼士：請(qǐng)勿讓裂解液處理的時(shí)間超過(guò)5分鐘。這樣做既能確保質(zhì)粒DNA得到的釋放，同時(shí)又能避免不可逆的質(zhì)粒降解。
3. 通過(guò)添加中和裂解液。注：高鹽度會(huì)造成十二烷基硫酸鉀(KDS)沉淀，且變性的蛋白質(zhì)、染色體DNA和細(xì)胞細(xì)胞碎片共沉淀在不溶的鹽洗滌劑復(fù)合物中。質(zhì)粒DNA（環(huán)狀和共價(jià)閉合形式）正確復(fù)性，并保留在溶液中。 
   小貼士：通過(guò)使用冷凍的中和液和在冰上孵育，可增強(qiáng)沉淀效果。
4. 通過(guò)離心或過(guò)濾方法，清洗裂解產(chǎn)物，沉淀出殘?jiān)?nbsp;
   注：傳統(tǒng)的做法是，來(lái)自于清洗后的細(xì)菌裂解液的質(zhì)粒DNA的純化，采用氯化銫(CsCl)超純法進(jìn)行純化。目前，市面上銷售有大量的商業(yè)質(zhì)粒純化試劑盒，可藉此完成各種通量要求和應(yīng)用需要的純化操作。

其它裂解方法

我們介紹了大量細(xì)菌細(xì)胞裂解的其它方法(1, 6)。其中的部分方法是針對(duì)其他應(yīng)用開(kāi)發(fā)的，并不適用于質(zhì)粒DNA制備。

• 煮沸裂解法：細(xì)菌細(xì)胞采用溶酶體來(lái)處理，以弱化細(xì)胞壁，然后通過(guò)在沸水中水浴約1分鐘加熱裂解細(xì)胞。
• 去污劑裂解：細(xì)菌細(xì)胞通過(guò)離子去污劑（例如，SDS）或非離子去污劑（例如，Triton X-100）處理的方式進(jìn)行裂解。
• 機(jī)械裂解：細(xì)菌細(xì)胞通過(guò)機(jī)械式破碎作用裂解（例如，通過(guò)超聲波處理）。 
• 酶促消化：有些裂解方法包括了采用酶（用于幫助弱化細(xì)胞壁）進(jìn)行的細(xì)菌處理步驟。 

大腸桿菌（E. coli）之外的細(xì)菌的裂解

從大腸桿菌（E. coli）之外的細(xì)菌中分離質(zhì)粒DNA時(shí)，為優(yōu)化特定種屬的裂解條件，通常需要修改裂解步驟。

DNA的轉(zhuǎn)化

制備感受態(tài)E. coli

具有（從各類來(lái)源）回收DNA能力的細(xì)胞被稱為“感受態(tài)”細(xì)胞?，F(xiàn)有多項(xiàng)技術(shù)可制備感受態(tài)細(xì)胞，其中的的一項(xiàng)制備感受態(tài)大腸桿菌(E. coli)的技術(shù)如下。

注：采用這一實(shí)驗(yàn)方案制備的細(xì)胞不宜用作電穿孔實(shí)驗(yàn)。

所需材料

• 儲(chǔ)存在甘油原液瓶中的E. coli
• LB培養(yǎng)基
• LB瓊脂糖平板
• 適當(dāng)?shù)暮Y選抗生素
• TFB1緩沖液（參見(jiàn)表Buffer TFB1）
• TFB2緩沖液（參見(jiàn)表Buffer TFB2）

1. 通過(guò)一根滅菌的牙簽或接種環(huán)從甘油原液瓶中取出痕量的大腸桿菌(E. coli)細(xì)胞，將其接種到含有適當(dāng)濃度的相關(guān)篩選抗生素的LB瓊脂糖平板上。如果宿主株系已經(jīng)過(guò)培養(yǎng)并儲(chǔ)存在2–8°C下（在保證活性和存活力無(wú)大幅下降的前提下，培養(yǎng)物zui多2–8°C條件下儲(chǔ)存3個(gè)月），則請(qǐng)從此類原液中挑出細(xì)菌。
2. 在37°C下孵育過(guò)夜。
3. 取一種菌落，接種到含有相關(guān)抗生素的10 ml LB培養(yǎng)基中。在37°C下生長(zhǎng)過(guò)夜。
4. 將1 ml過(guò)夜的培養(yǎng)物添加到100 ml含有相關(guān)抗生素的預(yù)熱LB培養(yǎng)基中，然后放入500 ml搖瓶中，在37°C條件下振蕩，直至OD₆₀₀達(dá)到0.5（約需要90–120分鐘）。
5. 在冰上冷卻培養(yǎng)物5分鐘，然后將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到無(wú)菌、圓底的離心管中。
6. 低速離心收集細(xì)胞（時(shí)長(zhǎng)5分鐘，速度4000 x g，溫度4°C）。
7. 小心地吸棄上清液。將細(xì)胞一直置于冰上。
8. 在冰冷的(4°C) TFB1緩沖液（30 ml，適于100 ml培養(yǎng)物）中輕輕地重懸細(xì)胞，然后將懸液在冰上再置于冰上90分鐘。
9. 離心收集細(xì)胞（時(shí)長(zhǎng)5分鐘，速度4000 x g，溫度4°C）。 
10. 小心地吸棄上清液。將細(xì)胞一直置于冰上。
11. 在4 ml冰冷的TFB2緩沖液中小心地重懸細(xì)胞。
12. 在無(wú)菌的微量離心管中制備成100–200 µl等份，在液氮或干冰-酒精混合液中冷凍。在–70°C下儲(chǔ)存感受態(tài)細(xì)胞。

轉(zhuǎn)化感受態(tài)E. coli

轉(zhuǎn)化是將質(zhì)粒DNA引入細(xì)菌宿主細(xì)胞的過(guò)程。有多種方法可供轉(zhuǎn)化細(xì)菌細(xì)胞，其中的一種方法如下。

• 感受態(tài)大腸桿菌(E. coli)細(xì)胞 
• SOC培養(yǎng)基
• LB瓊脂糖平板

1. 將一份準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染的等份DNA（10 µl或更少）轉(zhuǎn)移到冰冷、滅菌的1.5 ml微量離心管中，將其置于冰上。
2. 解凍放在冰上的一等份冰凍的感受態(tài)大腸桿菌(E. coli)細(xì)胞。 
3. 輕輕地重懸細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)移100 µl細(xì)胞懸液到含有質(zhì)粒DNA的微量離心管中，小心地混合，然后置于冰上約20分鐘。
4. 將離心管移到42°C水浴或恒溫槽中放置90秒。 
5. 向細(xì)胞中添加500 µl SOC培養(yǎng)基，在37°C下孵育60–90分鐘。 
   小貼士：振蕩可提升轉(zhuǎn)化效率。
6. 在含有相關(guān)抗生素的LB瓊脂糖平板中鋪盤(pán)成50、100和200 µl等份。在37°C下過(guò)夜孵育平板，直至菌落生長(zhǎng)成型。 

陽(yáng)性對(duì)照檢查轉(zhuǎn)化效率

采用1 ng含有抗抗生素基因的參比基因轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。鋪盤(pán)到含有相關(guān)抗生素的LB瓊脂糖平板上。比較采用對(duì)照質(zhì)粒獲得的菌落數(shù)量和采用感興趣的質(zhì)粒獲得的菌落數(shù)量，進(jìn)而比較轉(zhuǎn)化效率。

陰性對(duì)照檢查抗生素活性

在含有相關(guān)抗生素的單個(gè)LB瓊脂糖平板中鋪盤(pán)至少200 µl的轉(zhuǎn)化混合物。平板上沒(méi)有菌落則表示抗生素具有活性。

異丙醇沉淀DNA

乙醇沉淀法是常用的核酸濃縮、脫鹽和恢復(fù)方法。沉淀由高濃度的鹽和附加的異丙醇或乙醇成分介導(dǎo)。異丙醇沉淀法所需的乙醇量較少，因而成為了大批量DNA沉淀的首先方法。此外，異丙醇沉淀法可在室溫下進(jìn)行，可zui大限度減少感染下游應(yīng)用的鹽共沉淀現(xiàn)象。

1. 采用醋酸鈉（0.3 M，pH 5.2，終濃度）或醋酸銨（2.0–2.5 M，終濃度）等，視必要調(diào)節(jié)鹽濃度。
2. 向DNA溶液中添加0.6–0.7體積的室溫異丙醇，然后充分混合。
   小貼士：請(qǐng)?jiān)谑覝叵率褂盟腥芤?，以便zui大限度減少鹽共沉淀現(xiàn)象。 
   小貼士：請(qǐng)勿使用聚碳酸酯試管進(jìn)行沉淀，因?yàn)榫厶妓狨o(wú)耐異丙醇腐蝕能力。
3. 立即在4°C下以10,000–15,000 x g的速度離心樣本15–30分鐘。 
   小貼士：應(yīng)在4°C下離心，以防止樣本過(guò)熱。（小量沉淀時(shí)，可在室溫下離心。） 
   小貼士：也可在添加異丙醇后，使用玻璃棒，通過(guò)DNA螺旋化沉淀基因組DNA。螺旋化的DNA應(yīng)立即轉(zhuǎn)移到含有適當(dāng)?shù)木彌_液微量離心管中，然后再溶解（參見(jiàn)步驟9）。 
4. 在不破碎沉淀的前提下，小心地倒出上清液。  
   小貼士：在離心之前在試管外側(cè)做出標(biāo)記，可更輕松地確定不同的沉淀。異丙醇沉淀法的沉淀具有玻璃光澤外觀，相對(duì)于通過(guò)乙醇沉淀法獲得的蓬松的含鹽沉淀，更難以看到。
   小貼士：去除上清液時(shí)需小心處理，這是因?yàn)楫惐汲恋矸ǐ@得的沉淀會(huì)更疏松地粘附在試管一側(cè)。 
   小貼士：使沉淀處于上方，小心地傾倒試管，以免沉淀移動(dòng)。
   小貼士：對(duì)于較為珍貴的樣本，可保留上清液，直至已驗(yàn)證過(guò)沉淀DNA的恢復(fù)。 
5. 添加1–10 ml（具體取決于制備規(guī)格）室溫的70%乙醇，洗滌DNA沉淀。此步驟可去除共沉淀鹽，并用更具揮發(fā)性的乙醇代替異丙醇，讓DNA更易溶解。 
6. 在4°C下，以10,000–15,000 x g的速度下離心5–15分鐘。 
   小貼士：按照與之前的處理相同的方向離心試管，以便將DNA回收成緊湊的沉淀小球。
7. 在不破碎沉淀的前提下，小心地倒出上清液。  
8. 風(fēng)干沉淀5–20分鐘（具體取決于沉淀的尺寸）。 
   小貼士：請(qǐng)勿過(guò)度風(fēng)干沉淀（例如使用真空蒸發(fā)器），因?yàn)檫@會(huì)造成DNA，尤其是高分子DNA難以溶解。
9. 在適宜的緩沖液中重新溶解DNA。  
   小貼士：根據(jù)預(yù)期的DNA產(chǎn)量和所需的zui終DNA濃度，選擇適當(dāng)體積的緩沖液。  
   小貼士：請(qǐng)使用pH為7.5–8.0的緩沖液，因?yàn)镈NA不易在酸性緩沖液中溶解。（如采用水，則請(qǐng)核實(shí)其pH值。） 
   小貼士：請(qǐng)沖洗試管壁以回收全部的DNA，尤其是在使用玻璃試管時(shí)。為避免DNA剪切作用，請(qǐng)勿移液或渦旋。 
   小貼士：為避免出現(xiàn)剪切作用，應(yīng)非常溫和地再溶解高分子DNA（如基因組DNA），例如室溫下過(guò)夜，或者55°C下輕輕攪動(dòng)溶解1–2小時(shí)。

儲(chǔ)存DNA

純化的DNA應(yīng)在–20°C或–70°C下，在弱堿性環(huán)境（例如，pH 8.0的Tris?Cl或者TE緩沖液；參見(jiàn)表 1 mM Tris·Cl和TE緩沖液），因?yàn)樗嵝詶l件可造成DNA水解。請(qǐng)勿反復(fù)凍融，因?yàn)檫@會(huì)造成DNA沉淀。

稀釋后的核酸溶液（例如，用作標(biāo)準(zhǔn)品的倍比稀釋系列）應(yīng)分成等份儲(chǔ)存（如有可能，請(qǐng)儲(chǔ)存在硅膠管中），并僅融解一次。這種處理可避免核酸吸附在試管壁上，從而造成溶液中的核酸濃度下降。

內(nèi)毒素及其注意事項(xiàng)

何為內(nèi)毒素？

內(nèi)毒素又名lipopolysaccharides或LPS，是革蘭氏陰性細(xì)菌（例如，大腸桿菌(E. coli)）的細(xì)胞膜成分。細(xì)胞膜外膜的外層脂質(zhì)部分全部由內(nèi)毒素分子組成。一個(gè)大腸桿菌(E. coli)細(xì)胞約含有2百萬(wàn)個(gè)LPS分子，而每個(gè)LPS分子又包含一個(gè)疏水脂質(zhì)A部分、一個(gè)糖殘基復(fù)合物陣列，以及一個(gè)帶負(fù)電的磷酸鹽基團(tuán)。因此，每個(gè)內(nèi)毒素分子處理疏水、親水和帶電的區(qū)域，使其具備了與其他分子相互作用的*功能。細(xì)菌積極生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)向周圍的環(huán)境排出少量的內(nèi)毒素，而在其死亡時(shí)則會(huì)一次性釋放大量?jī)?nèi)毒素。為制備質(zhì)粒而裂解細(xì)菌細(xì)胞時(shí)，內(nèi)毒素分子從細(xì)胞外膜釋放到裂解液中。

內(nèi)毒素能夠大幅降低內(nèi)毒素敏感細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染效率。此外，在轉(zhuǎn)染試驗(yàn)中，內(nèi)毒素還會(huì)和DNA競(jìng)爭(zhēng)“游離”的轉(zhuǎn)染試劑，影響質(zhì)粒DNA的回收。總而言之，內(nèi)毒素代表了轉(zhuǎn)染試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的一種不可控變量。它們?cè)诃傊悄z中不可見(jiàn)，無(wú)法通過(guò)光密度法檢測(cè)出來(lái)，且會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果和結(jié)果的可重現(xiàn)性，使您難以對(duì)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)和解釋。

不同質(zhì)粒制備方法的內(nèi)毒素污染

內(nèi)毒素分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，以及其易于形成膠束的趨向，都使其可以與質(zhì)粒DNA共純化。例如，在CsCl超速離心法中，CsCl分帶的DNA易受內(nèi)毒素分子污染，在CsCl中，內(nèi)毒素分子具有與質(zhì)粒-溴化乙錠復(fù)合物類似的密度。

在尺寸排阻樹(shù)脂中，內(nèi)毒素組成的膠束尺寸較大，會(huì)使內(nèi)毒素分子的行為表現(xiàn)類似于DNA大分子，在陰離子交換色譜柱中，內(nèi)毒素上存在的負(fù)電荷可與陰離子交換樹(shù)脂相互作用，導(dǎo)致內(nèi)毒素和質(zhì)粒DNA共純化。

即便如此，質(zhì)粒DNA中存在的內(nèi)毒素污染水平仍然依賴于所選用的純化方法。

如何測(cè)定內(nèi)毒素？

傳統(tǒng)的做法是，通過(guò)內(nèi)毒素和海鱟(Limulus polyphemus)的阿米巴樣細(xì)胞凝固蛋白之間的凝聚反應(yīng)來(lái)測(cè)定內(nèi)毒素。

如今則采用靈敏度高得多的光度測(cè)定法（例如，BioWhittaker, Inc.的Kinetic-QCL測(cè)定），該法基于鱟阿米巴樣細(xì)胞溶解物(LAL)和合成生色底物。LPS污染程度通常以內(nèi)毒素單位(EU)來(lái)表示。通常情況下，1 ng LPS對(duì)應(yīng)于1–10 EU。

內(nèi)毒素對(duì)生物應(yīng)用的影響

內(nèi)毒素會(huì)大幅影響DNA轉(zhuǎn)染進(jìn)原代細(xì)胞核敏感培養(yǎng)的細(xì)胞，較高的內(nèi)毒素水平還會(huì)顯著降低沾染效率。此外，在基因療法應(yīng)用中采用不含內(nèi)毒素的質(zhì)粒DNA也非常重要，這是因?yàn)閮?nèi)毒素會(huì)引起動(dòng)物和人發(fā)燒、內(nèi)毒素休克綜合征、以及補(bǔ)體級(jí)聯(lián)激活等臨床癥狀。

內(nèi)毒素還會(huì)通過(guò)免疫反應(yīng)非特異性激活，干擾體外轉(zhuǎn)染進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞（例如巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞）。此類反應(yīng)包括免疫介導(dǎo)物（例如，IL-1和前列腺素）的誘導(dǎo)合成。為避免誤讀實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確保塑料器皿、培養(yǎng)基、血清和質(zhì)粒DNA不含LPS污染物非常重要。

不含內(nèi)毒素的塑料和玻璃器皿

為避免在初次內(nèi)毒素去除之后質(zhì)粒DNA被二度污染，建議僅使用經(jīng)認(rèn)證不含致熱源、不含內(nèi)毒素的新塑料制品。不含內(nèi)毒素、不含致熱源的塑料制品可自很多供應(yīng)商處購(gòu)買。

內(nèi)毒素對(duì)玻璃制品具有較強(qiáng)的吸附性，在洗滌時(shí)難以*清除。標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室高壓滅菌操作對(duì)內(nèi)毒素水平無(wú)影響或者影響很小。此外，如果之前已采用高壓滅菌設(shè)備處理過(guò)細(xì)菌，玻璃制品會(huì)受到內(nèi)毒素分子過(guò)渡污染。為*殺滅粘附的內(nèi)毒素分子，建議在180°C下過(guò)夜加熱玻璃制品。

此外，使用不含內(nèi)毒素的試劑，避免純化的不含內(nèi)毒素DNA不受二度污染非常重要。

定量DNA

對(duì)于很多分子生物學(xué)應(yīng)用，可靠測(cè)定DNA濃度非常重要。分光光度測(cè)定法和熒光測(cè)定法是常用的基因組和質(zhì)粒DNA濃度測(cè)定方法。分光光度測(cè)定法可用于測(cè)定微克量級(jí)的純DNA樣本（即，不受蛋白質(zhì)、苯酚、瓊脂糖或RNA污染的DNA）。熒光測(cè)定法更敏感，可測(cè)定納克量級(jí)的DNA，此外使用Hoechst 33258染料可以對(duì)DNA進(jìn)行特異性分析。

分光光度測(cè)定法

可通過(guò)在石英分光比色液槽中，用分光光度計(jì)測(cè)定260 nm (A₂₆₀)下的吸光度來(lái)測(cè)定DNA濃度。為確保zui高的精度，讀數(shù)應(yīng)處于0.1和1.0之間。260 nm處1單位的吸光度，對(duì)應(yīng)于每ml內(nèi)50 µg基因組DNA（A₂₆₀ =1對(duì)應(yīng)于50 µg/ml；基于標(biāo)準(zhǔn)的1 cm通道長(zhǎng)度。這一關(guān)系僅在中性PH下測(cè)定時(shí)有效，因此樣品應(yīng)采用中性PH的低鹽緩沖液（例如，pH 7.0的Tris•Cl）稀釋。

處理少量DNA時(shí)，諸如使用純化后的PCR產(chǎn)物或提取自瓊脂糖凝膠的DNA片段，通過(guò)瓊脂糖凝膠分析定量將更有效。

小貼士：如果您使用多個(gè)比色皿測(cè)定多個(gè)樣本，所用的各個(gè)比色皿必須相匹配。

小貼士：分光光度法測(cè)定并不區(qū)分DNA和RNA，因此RNA污染物會(huì)造成估算出的DNA濃度虛高。

小貼士：苯酚具有zui高270–275 nm的吸光范圍，與DNA的吸光范圍比較接近。苯酚污染物會(huì)造成虛假的高產(chǎn)量和高純度，這是因?yàn)?em>A₂₆₀值出現(xiàn)上調(diào)。

溶劑對(duì)分光光度計(jì)讀數(shù)的影響

核酸的吸光度取決于溶解核酸所用的溶劑(7)。使用低鹽度緩沖液時(shí)，A₂₆₀數(shù)值可重現(xiàn)，但如果使用水，則不可實(shí)現(xiàn)。由于空氣中CO2溶解而引起的水PH值變化時(shí)，很可能出現(xiàn)這種情況。在水中測(cè)定的A₂₆₀/A₂₈₀比率也會(huì)引起讀數(shù)（參見(jiàn)溶劑對(duì)A₂₆₀/A₂₈₀比率的影響）出現(xiàn)較大波動(dòng)，通常獲得的比率<1.8，這會(huì)造成對(duì)蛋白污染物的敏感度下降(7)。相反，在低鹽、弱堿性PH值的緩沖液下測(cè)得的A₂₆₀/A₂₈₀比率通常是可重現(xiàn)的。

RNA污染對(duì)分光光度讀數(shù)的影響

根據(jù)所使用的DNA分離方法，RNA將與基因組DNA共同純化。RNA可能會(huì)抑制一些下游的應(yīng)用，但它不會(huì)抑制PCR。分光光度法測(cè)量不能分辨DNA和RNA，所以RNA的污染可導(dǎo)致DNA濃度被高估。雖然不能被有效地定量檢測(cè)，RNA污染有時(shí)仍可以通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析配合常規(guī)溴化乙錠染色進(jìn)行檢測(cè)。RNA條帶出現(xiàn)模糊和污染，并且只在≥25-30 ng可以被檢測(cè)到（RNA：DNA的比例為0.5:1 ）。

RNase A處理將去除被污染的RNA，這可以合并到純化步驟中或在DNA被純化后進(jìn)行。在使用之前，為了破壞任何可能存在的DNase活性污染，請(qǐng)確保RNase A的溶液已經(jīng)被熱處理過(guò)?；蛘撸褂脧囊粋€(gè)可靠的供應(yīng)商處購(gòu)買的去DNase的RNase。

質(zhì)粒DNA的RNA污染取決于質(zhì)粒的制備方法。使用堿裂解與苯酚抽提的方法不能從質(zhì)粒DNA中分離出RNA，從而導(dǎo)致高水平的RNA污染。的陰離子交換技術(shù)可以分離高分子量的不含RNA的基因組DNA。

DNA的純度

在260 nm和280 nm處的讀數(shù)比值（A₂₆₀/A₂₈₀）提供了相對(duì)于吸收紫外光污染物（如蛋白質(zhì)）的DNA純度估計(jì)值。A₂₆₀/A₂₈₀比值受pH值影響顯著。由于沒(méi)有緩沖作用，pH值和由此產(chǎn)生的A₂₆₀/A₂₈₀比值可以變化很大。較低的pH值會(huì)導(dǎo)致較低的A₂₆₀/A₂₈₀比值，同時(shí)降低對(duì)蛋白質(zhì)污染的敏感性（7）。為獲得的A₂₆₀/A₂₈₀值，我們建議在微堿性緩沖液中測(cè)量吸光度（如10 mM Tris•Cl, pH 7.5）。一定要使用適當(dāng)?shù)木彌_液對(duì)分光光度計(jì)較零。

純DNA A₂₆₀/A₂₈₀比值為1.7–1.9。在220–320 nm之間掃描吸光度，將顯示在260 nm處是否有污染物影響吸光度。吸光度掃描曲線應(yīng)該在260 nm出現(xiàn)峰值并且整體平滑。

熒光分析法

熒光分析法通過(guò)使用熒光染料可以對(duì)DNA濃度進(jìn)行特異性、靈敏的測(cè)定，其可采用包括Hoechst染料和PicoGreen在內(nèi)的常見(jiàn)染料。

Hoechst3258對(duì)RNA的親和力較小，可以定量被RNA污染的DNA樣品。這表明與DNA結(jié)合后在458 nm熒光值增加。DNA標(biāo)準(zhǔn)品和樣品與Hoechst33258混合，使用掃描型熒光分光光度計(jì)或?yàn)V波器熒光計(jì)在365 nm激發(fā)波長(zhǎng)和460 nm發(fā)射波長(zhǎng)在玻璃或丙烯酸比色皿中測(cè)定。樣品測(cè)量結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較，以確定DNA濃度。

小貼士：因?yàn)镠oechst33258優(yōu)先與AT富集的DNA結(jié)合，請(qǐng)使用與DNA樣品具有類似堿基組成的標(biāo)準(zhǔn)品。

PicoGreen測(cè)定法對(duì)dsDNA高度敏感，可以在200 µl體積中測(cè)量低至20 pg的dsDNA。其實(shí)，從500 pg/ml到500 ng/ml濃度的DNA都可以使用單一濃度的染料測(cè)定。該測(cè)定已經(jīng)過(guò)優(yōu)化，可zui大限度減少RNA和ssDNA的熒光值，使得dsDNA可以在等摩爾濃度的ssDNA和RNA存在的情況下定量，并zui大限度減少二者定量結(jié)果的影響。

瓊脂糖凝膠

瓊脂糖凝膠電泳分析能夠快速而簡(jiǎn)單地定量檢測(cè)DNA，特別是小DNA片段（如PCR產(chǎn)物）。少至20 ng的DNA都可通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳配合溴化乙錠染色進(jìn)行檢測(cè)。在瓊脂糖凝膠上，DNA樣品是在已知量的相同或類似大小DNA的旁邊進(jìn)行電泳。加樣的樣品DNA的量可通過(guò)可視化或成像系統(tǒng)掃描其條帶強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)比來(lái)估計(jì)。標(biāo)準(zhǔn)品的片段大小請(qǐng)務(wù)必與目的基因大致相同，以確保DNA含量評(píng)估的可靠性，因?yàn)檩^大片段比小片段更易螯合染料，形成更強(qiáng)的條帶強(qiáng)度。

更的瓊脂糖凝膠定量可以通過(guò)密度計(jì)分辨條帶強(qiáng)度，并與使用已知濃度的DNA所產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)中的有效密度定量范圍在20–100 ng之間。

小貼士：用于密度定量的DNA量應(yīng)落在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)。

有關(guān)瓊脂糖凝膠電泳更多的信息請(qǐng)見(jiàn)使用凝膠分析DNA 。

DNA的限制性內(nèi)切酶消化

限制性內(nèi)切酶消化原理

許多應(yīng)用都需要使用限制性內(nèi)切酶將gDNA轉(zhuǎn)換為大小適宜的片段。這一處理可獲得大小適宜、利于下游操作的DNA片段。限制性內(nèi)切酶是一種可以在特異性靶序列內(nèi)結(jié)合和剪切DNA的細(xì)菌酶。II型限制性內(nèi)切酶是分子生物學(xué)中zui廣泛使用的工具。它們?cè)谔禺愋宰R(shí)別位點(diǎn)結(jié)合DNA，其中包括一個(gè)短回文序列，并且在該位點(diǎn)內(nèi)裂解，例如，AGCT（用于AluI）中，GAATTC（ 用于EcoRI）等。同裂酶是一種不同的酶，他們具有相同的特異性，并在某些情況下還具有相同的剪切類型。

小貼士：同裂酶屬性可能略有不同，這點(diǎn)非常有用。例如，MboI和Sau3A酶具有相同的序列特異性，但MboI不剪切甲基化DNA，而Sau3A可以。因此，在需要的時(shí)候，Sau3A可以用來(lái)代替MboI。

選擇合適的限制性內(nèi)切酶

選擇合適的限制性內(nèi)切酶時(shí)需要考慮以下幾個(gè)因素：

• 片段大小
• 甲基化敏感性
• 平端/粘性末端片段
• 反應(yīng)條件的相容性（使用一個(gè)以上的酶時(shí)）

片段大小

限制性內(nèi)切酶具有較短的識(shí)別序列并且比那些具有較長(zhǎng)識(shí)別序列的酶剪切的更為頻繁。例如，一個(gè)4堿基對(duì)（bp）的剪切酶平均剪切4⁴（256）個(gè)堿基，而一個(gè)6 bp的剪切酶平均剪切4⁶（4096）個(gè)堿基。

小貼士：定位基因組DNA或YAC、BAC或者P1可使用6 bp剪切酶，因?yàn)檫@些酶剪切片段的大小范圍適合于克隆。

甲基化

許多有機(jī)體具有一種被稱為甲基化酶的酶，可以在特定序列將DNA甲基化。當(dāng)位點(diǎn)被甲基化后，不是所有的限制性內(nèi)切酶都能剪切其識(shí)別的位點(diǎn)。因此，限制性內(nèi)切酶的選擇受其對(duì)甲基化敏感性的影響。此外，甲基化模式在不同的物種間具有差異，這也影響到限制性內(nèi)切酶的選擇。

• 與概率預(yù)期相比，CpG二核苷酸在哺乳動(dòng)物DNA中發(fā)生甲基化大約減少5倍量，如果胞嘧啶被甲基化，則大多數(shù)限制性內(nèi)切酶在CpG二核苷酸識(shí)別位點(diǎn)無(wú)法剪切。因此，許多酶在CpG的識(shí)別位點(diǎn)，如 EagI、NotI和SalI很少剪切哺乳動(dòng)物DNA。
• 果蠅、線蟲(chóng)和其它一些物種不具有甲基化的DNA，并其CpG二核苷酸的含量比例高于哺乳動(dòng)物。因此Rare剪切酶在這些物種中的剪切更加頻繁。
• 植物的DNA是高度甲基化的，所以為了在植物中成功定位，所選擇的酶要么在其識(shí)別位點(diǎn)不含有CpG二核苷酸（例如DraI或SspI），要么可以剪切甲基化的CpG二核苷酸（例如，BamHI、KpnI或者TaqI）。

小貼士：細(xì)菌和真核生物之間的甲基化類型不同，所以克隆和非克隆DNA的限制帶型可能會(huì)有所不同。

小貼士：不同真核生物之間的甲基化類型也不同（見(jiàn)以上圖表），并影響構(gòu)建基因組DNA文庫(kù)的限制性內(nèi)切酶的選擇。

平端/粘性末端片段

有些限制性內(nèi)切酶剪切識(shí)別位點(diǎn)的中段，產(chǎn)生平端的DNA片段。然而，大多數(shù)酶的剪切交錯(cuò)在每條鏈上，導(dǎo)致在每個(gè)片段的末端出現(xiàn)含有數(shù)個(gè)堿基對(duì)的單鏈DNA，被稱為“粘性”末端。有些酶剪切出5'突出端而其他一些則剪切出3'突出端。剪切的類型會(huì)影響下游克隆的難易：

• 粘性末端片段可以輕易連接到具有單鏈突出端的其他片段的粘性末端，從而產(chǎn)生的克隆。
• 平末端片段的連接效率通常要少得多，使得其克隆更加困難。然而，任何平端片段可以與任何其他的平端相連接，所以當(dāng)不能生成親和的粘性末端片段時(shí)，就要使用平端剪切酶，例如，如果載體的多接頭位點(diǎn)不含有被克隆片段的酶親和位點(diǎn)。

反應(yīng)條件的相容性

如果使用一種以上的酶對(duì)DNA片段進(jìn)行剪切，這兩種酶可以同時(shí)添加到反應(yīng)中，前提是它們?cè)谙嗤木彌_液中活性相同并可在同一溫度下進(jìn)行反應(yīng)。如果酶不具有親和的反應(yīng)條件，有必要對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行剪切、純化，然后進(jìn)行第二次剪切。

限制性剪切成分

• 水
• DNA
• 緩沖液
• 酶

剪切的DNA量依賴于下游應(yīng)用和被分析生物的基因組大小。我們建議哺乳動(dòng)物和植物基因組DNA蛋白印跡法每次反應(yīng)使用至少10 µg的DNA。為了定位克隆DNA，每個(gè)反應(yīng)0.2–1 µg DNA足夠。

小貼士： DNA應(yīng)無(wú)苯酚、氯仿、乙醇，洗滌劑或鹽等污染，因?yàn)檫@些污染物可能對(duì)限制性內(nèi)切酶活性造成干擾。

一單位的限制性內(nèi)切酶在1小時(shí)內(nèi)可以*剪切1 µg底物DNA。然而，超螺旋質(zhì)粒DNA通常需要超過(guò)1個(gè)單位/µg的酶才能被*剪切。為了確保*剪切，大多數(shù)研究人員加入10倍過(guò)量的限制酶確保*反應(yīng)。

小貼士：請(qǐng)確保限制性內(nèi)切酶不超過(guò)總反應(yīng)體積的10％，否則承載酶的甘油可能會(huì)抑制剪切。

反應(yīng)體積

大多數(shù)剪切是在10–50 µl的體積中進(jìn)行。（反應(yīng)體積小于10 µl易受移液誤差影響，不使用。）

限制性酶切準(zhǔn)備

1. 將反應(yīng)組分移液到皮氏管中并用移液槍拌勻。
   小貼士：*混合非常重要。
   小貼士：酶應(yīng)保持在冰上并在zui后添加。 
   小貼士：當(dāng)準(zhǔn)備大量的剪切反應(yīng)，用緩沖液和酶配制反應(yīng)預(yù)混液，并等分到含有被剪切DNA的皮氏管中。
2. 短暫離心后收集底部的液體。
3. 使用水浴或加熱模塊在37℃孵育剪切反應(yīng)，通常需要1-4小時(shí)。然而一些限制性內(nèi)切酶需要更高的孵育溫度（如50–65℃），而其他則要求較低的（如25℃）孵育溫度。
4. 對(duì)于一些下游應(yīng)用，有必要在剪切反應(yīng)后熱滅活酶。剪切反應(yīng)后加熱至65℃保持20分鐘，滅活大多數(shù)*孵育溫度為37℃的酶。注意，某些限制性內(nèi)切酶并不能*被熱處理滅活。