試劑

1M LiCl 用去離子蒸餾水配制，0.22um濾膜過濾除菌；必要時用消毒去離子水稀釋

50% PEG3350 Sigma P3640? 用去離子蒸餾水配制，0.45um濾膜過濾除菌，用較緊的蓋子的瓶子分裝 (氯化鋰轉(zhuǎn)化法只能PEG3350,不能用PEG8000,PEG3350在北京萊博生物有售,80元/100克)

2mg/ml salmon sperm DNA / TE（10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA）-20℃保存

注：醋酸鋰對畢氏酵母無效,對釀酒酵母有效，僅氯化鋰有效；PEG3350可屏蔽高濃度LiCl的毒害作用。

感受態(tài)畢氏酵母的制備

1. 接種Pachia pastoris到50ml YPD培養(yǎng)基中，30℃搖菌過夜（約24～28h）培養(yǎng)到OD值為0.8～1.0（約108 Cells/ml）；培養(yǎng)基里有流沙樣的菌體在流動

2. 收獲細胞，用25ml無菌水洗滌一次，室溫下1500g離心10min；

3. 重懸細胞于1ml 100mM LiCl溶液中，將懸液轉(zhuǎn)入1.5ml離心管；

4. 離心機zui大速度離心15秒沉淀菌體，重懸菌體于400ul 100mM LiCl溶液中；

5. 按50ul/管分裝，立即進行轉(zhuǎn)化；

注：不要將感受態(tài)酵母菌冰浴；

畢氏酵母的轉(zhuǎn)化

1. 煮沸1ml鮭魚精DNA 5min，迅速冰浴以制備單鏈擔(dān)體DNA；鮭魚精DNA主要是防止目的基因的降解，協(xié)助目的基因的轉(zhuǎn)化

2. 將感受態(tài)酵母菌離心，以Tips去除殘余的LiCl溶液；

3. 對于每一個轉(zhuǎn)化，按以下順序加入：

50% PEG3350????????????????????? 240ul

1M LiCl?????????????????????????? 36ul

2mg/ml 單鏈Salmon sperm DNA?????? 25ul

5～10ug/50ul H2O 質(zhì)粒DNA????????? 50ul

4. 劇烈旋渦混勻直至沉淀菌體*分布均勻（約1min）；

5. 30℃水浴孵育30min；

6. 42℃水浴熱休克20～25min;

7. 6000～8000rpm離心收集酵母菌體；

8. 重懸酵母于1ml YPD培養(yǎng)基，30℃搖床孵育；

9. 1～4h后，取25～100ul菌液鋪選擇性培養(yǎng)基平板，于30℃培養(yǎng)2～3天鑒定；

畢氏酵母PEG1000轉(zhuǎn)化法

試劑

緩沖液A：1.0M Sorbitol，10mM Bicine，pH8.35（sigma）,3%（v/v）ethylene glycol

緩沖液B：40%（w/v）PEG1000（sigma），0.2M Bicine，pH8.35

緩沖液C：0.15M NaCl，10mM Bicine，pH8.35

未污染的新鮮、試劑級DMSO，-70℃保存

注：1. 緩沖液A、B、C均用濾膜過濾，-20℃保存;

2. 將DNA直接加在凍結(jié)的酵母細胞上是本實驗的關(guān)鍵之處（即使在冰上解凍的待轉(zhuǎn)化細胞，其攝取外源DNA的能力也在解凍過程中迅速下降；如進行多樣品的轉(zhuǎn)化，建議按6樣品/組進行）;

待轉(zhuǎn)化畢氏酵母的制備

1. 接種環(huán)接種Pachia pastoris于YPD平板，30℃培養(yǎng)2d;

2. 挑取單克隆酵母菌株于10mlYPD培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)過夜；

3. 取步驟2中小量菌液接種到100mlYPD培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，待其OD值從0.1升到0.5～0.8；

4. 室溫下3000g離心收集酵母菌體，50ml緩沖液A洗滌一次；

5. 重懸菌體于4ml緩沖液A中，按0.2ml/管分裝于1.5ml的離心管中，每管加入11ulDMSO，混合后迅速于液氮中冷凍，

6. -70℃保存

畢氏酵母的轉(zhuǎn)化

1. 將約50ug線性化質(zhì)粒DNA溶于20ul TE或水中，直接加于凍結(jié)的酵母細胞中；加入擔(dān)體DNA（40ug變性超聲線性化鮭魚精DNA）以獲得zui大轉(zhuǎn)化率；

2. 37℃水浴孵育5min，中間混合樣品1～2次；

3. 取出離心管，加入1.5ml緩沖液B，*混勻；

4. 30℃水浴孵育1h；

5. 室溫下2000g離心10min，去除上清液，菌體沉淀重懸于1.5ml緩沖液C中；

6. 離心樣品，去除上清液，輕微操作將樣品重懸于0.2ml緩沖液C中；

7. 將所有轉(zhuǎn)化液鋪于選擇性平板，于30℃孵育3～4天后，鑒定；

畢赤酵母轉(zhuǎn)化方法zui常用的是電轉(zhuǎn)化法和原生質(zhì)體法,其中電轉(zhuǎn)化法zui為方便,轉(zhuǎn)化效率zui高,zui容易產(chǎn)生多拷貝整合。由于原生質(zhì)體法必須首先制備去除細胞壁(cell wall)的原生質(zhì)體細胞以利于DNA 進入,然后細胞再生細胞壁(cell wall),產(chǎn)生轉(zhuǎn)化體,而ZeocinR 抑制細胞壁(cell wall)的形成,導(dǎo)致不能產(chǎn)生轉(zhuǎn)化體。因此利用ZeocinR 作為選擇標(biāo)記的載體如p PICZ 系列,不能使用原生質(zhì)體法進行轉(zhuǎn)化。