Southern印跡技術(shù)
目的要求
了解并掌握Southern印跡技術(shù)的原理和方法
實(shí)驗(yàn)原理
Southern印跡是將DNA片段從電泳凝膠上直接轉(zhuǎn)移至膜支持物（如硝酸纖維素膜、尼龍膜）上，使DNA片段固定的技術(shù)。先將DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化成一系列片段，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，各片段因相對(duì)分子質(zhì)量不同而彼此分開，然后經(jīng)堿處理凝膠，使DNA的片段被變性、中和并通過毛細(xì)作用在高鹽緩沖液中在原位將單鏈核酸轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜上，烘干、固定。
試劑和器材
1、試劑
變性液：1.5mol/L，NaCI，0.5mol/L，NaOH。
中和液：0.5mol/L，Tris-HCI（pH=7.0），1.5mol/L,NaCI。
20×SSC：3mol/L，NaCI，0.3mol/L檸檬酸鈉。
以上溶液均在100kPa滅菌20min。
2×SSC：用無菌移液管吸取20×SSC溶液5mL，加無菌水45mL。
6×SSC：用無菌移液管吸取20×SSC溶液15mL，加無菌水75mL。
2、器材
22cm×15cm瓷盤。
操作方法
1、在瓊脂糖凝膠上電泳分離DNA。取出凝膠，切去邊緣多于部分，EB染色，在紫外燈下照相（放一標(biāo)尺，可從相片中讀出DNA遷移的距離）。
2、將凝膠置于200mL變性液中，浸泡45min，并溫和地不斷振蕩，使凝膠上的ds-DNA轉(zhuǎn)變?yōu)镾S-DNA，然后用重蒸水沖洗凝膠幾次。
3、用中和液浸泡凝膠并不斷地振蕩45min，將凝膠中和至和性。防止凝膠的堿性破壞硝酸纖維膜。
4、取一個(gè)瓷盤，在底部放一塊玻璃板（或一塊海綿）使盛器內(nèi)的20倍SSC轉(zhuǎn)移濾液低于玻板表面，在玻板表面蓋一張3mm的二號(hào)濾紙，濾紙兩邊浸沒于20倍SSC溶液中，在玻璃和濾紙之間，趕掉所有的氣泡。
5、把凝膠地面朝上放在濾紙上，趕走兩層之間出現(xiàn)的氣泡。
6、裁剪一張硝酸纖維膜，其長(zhǎng)與寬大于凝膠1～2mm，并在角上作記號(hào)，以確定濾膜方位。先把它放在去離子水中潤(rùn)濕后，再放在20倍SSC溶液中潤(rùn)濕5min，然后放在凝膠表面，兩層之間不可有氣泡。
7、然后再把兩張與濾膜一樣大小的二號(hào)濾紙，在2倍SSC溶液中浸濕，覆蓋在硝酸纖維膜上，同樣要把氣泡趕走。
8、把一疊吸水紙（或衛(wèi)生紙，約有5～8cm高，略小于濾紙），放置在濾紙上，在吸水紙上再放一塊玻璃板和重約500g的重物，放置過夜。
9、轉(zhuǎn)移結(jié)束后，移去上面的吸水紙和濾紙，同時(shí)翻轉(zhuǎn)取出凝膠與硝酸纖維膜，把凝膠的點(diǎn)樣孔與硝酸纖維膜的相對(duì)應(yīng)位置用鉛筆或解剖針的針尖做好標(biāo)記。
10、把已轉(zhuǎn)移了DNA的硝酸纖維膜放在6倍SSC溶液中振蕩浸泡5min，然后放在濾紙上吸干溶液。再把它夾在兩層濾紙之間，80℃真空干燥2h。
注意事項(xiàng)
1、將凝膠中和至中性時(shí)，要測(cè)pH，防止凝膠的堿性破壞硝酸纖維膜。
2、要注意趕走凝膠和濾紙及硝酸纖維素膜之間的氣泡。
會(huì)員1.png)