本實(shí)驗(yàn)的目的是學(xué)會(huì)各種蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法。了解各種測(cè)定方法的基本原理和優(yōu)缺點(diǎn)。
目前常用的有四種古老的經(jīng)典方法，即定氮法，雙縮尿法(Biuret法)、Folin－酚試劑法(Lowry法)和紫外吸收法。另外還有一種近十年才普遍使用起來的新的測(cè)定法，即考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)。其中Bradford法和Lowry法靈敏度zui高，比紫外吸收法靈敏10～20倍，比Biuret法靈敏100倍以上。定氮法雖然比較復(fù)雜，但較準(zhǔn)確，往往以定氮法測(cè)定的蛋白質(zhì)作為其他方法的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。
值得注意的是，這后四種方法并不能在任何條件下適用于任何形式的蛋白質(zhì)，因?yàn)橐环N蛋白質(zhì)溶液用這四種方法測(cè)定，有可能得出四種不同的結(jié)果。每種測(cè)定法都不是無缺的，都有其優(yōu)缺點(diǎn)。在選擇方法時(shí)應(yīng)考慮：①實(shí)驗(yàn)對(duì)測(cè)定所要求的靈敏度和度；②蛋白質(zhì)的性質(zhì)；③溶液中存在的干擾物質(zhì)；④測(cè)定所要花費(fèi)的時(shí)間。
考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)，由于其突出的優(yōu)點(diǎn)，正得到越來越廣泛的應(yīng)用。
一、雙縮脲法(Biuret法)
(一)實(shí)驗(yàn)原理
雙縮脲(NH3CONHCONH3)是兩 個(gè)分子脲經(jīng)180℃左右加熱，放出一個(gè)分子氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵，或能過一個(gè)中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。
操作方法：
1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定：取12支試管分兩組，分別加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用水補(bǔ)足到1毫升，然后加入4毫升雙縮脲試劑。充分搖勻后，在室溫(20~25℃)下放置30分鐘，于540nm處進(jìn)行比色測(cè)定。用未加蛋白質(zhì)溶液的*支試管作為空白對(duì)照液。取兩組測(cè)定的平均值，以蛋白質(zhì)的含量為橫座標(biāo)，光吸收值為縱座標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2、樣品的測(cè)定：取2~3個(gè)試管，用上述同樣的方法，測(cè)定未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。注意樣品濃度不要超過10mg/ml。
二、微量凱氏(Kjeldahl)定氮法
樣品與濃硫 酸共熱。含氮有機(jī)物即分解產(chǎn)生氨(消化)，氨又與硫 酸作用，變成硫 酸氨。