實(shí)驗(yàn)方法原理 凡鹽析所獲得的粗制蛋白質(zhì)（鹽析得到的IgG）中均含有硫酸銨等鹽類，這類將影響以后的純化，所以純化前均應(yīng)除去，此過程稱為“脫鹽"（desalthing）。脫鹽常用透析法和凝膠過濾法，這兩種方法各有利弊。前者的優(yōu)點(diǎn)是透析后析品終體積較小，但所需時(shí)間較長(zhǎng)，且鹽不易除盡；凝膠過濾法則能將鹽除盡，所需時(shí)間也短，但其凝膠過濾后樣品體積較大。所以，要根據(jù)具體情況選擇使用。前實(shí)驗(yàn)中樣品體積較小，凝膠達(dá)濾后樣品體積不會(huì)太增加，所以選用凝膠過濾法。
實(shí)驗(yàn)材料 Sephadex G-25葡聚糖凝膠G-25
試劑、試劑盒 磷酸鹽緩沖液*碘汞蒸餾水磺基水楊酸溶液
儀器、耗材 錐形瓶量筒層析柱比色磁盤試管皮頭滴管
實(shí)驗(yàn)步驟
一、試劑與器材
1. Sephadex G-25。
2. 0.0175 mol/L，pH6.7磷酸鹽緩沖液。
3. 奈氏（Nessler）試劑：于500 ml錐形瓶?jī)?nèi)加入*150 g，碘110 g，汞150 g及蒸餾水100 ml。用力振蕩7～15 min，至碘的棕色開始轉(zhuǎn)變時(shí)，混合液溫度升高，將此瓶浸于冷水內(nèi)繼續(xù)振蕩，直到棕色的碘轉(zhuǎn)變?yōu)閹ЬG色的*汞液為止。將上清液傾入2000 ml量筒內(nèi)，加蒸餾水至2000 ml，混勻備用。
4. 20%（W/V）磺基水楊酸溶液。
5. 1.5cm×20 cm層析柱。
6. 黑、白比色磁盤。
二、操作
1. 取層析柱1支（1.5 cm×20 cm），垂直固定在支架上，關(guān)閉下端出口。將已經(jīng)溶脹好的Sephadex G-25中的水傾倒出去，加入2倍體積的0.0175 mol/L，pH6.7磷酸鹽緩沖液，并攪拌成懸浮液，然后灌注入柱，打開柱的下端出口，繼續(xù)加入攪勻的Sephadex G-25，使凝膠自然沉降高度到17 cm左右，關(guān)閉出口。待凝膠柱形成后，在洗脫瓶中加入0.0175 mol/L，pH6.7磷酸鹽緩沖液以3倍柱體積的磷酸鹽緩沖流過凝膠柱，以平衡凝膠。
2. 凝膠平衡后，用皮頭滴管除去凝膠柱面的溶液，將鹽析所得全部IgG樣品加到凝膠柱表面，打開柱下口，控制流速讓IgG樣品溶液慢慢浸入凝膠內(nèi)。凝膠柱面上加一層的0.0175 mol/L，pH6.7磷酸鹽緩沖液，并用此緩沖液洗脫，控制流速為0.5 ml/min左右。用試管收集洗脫液，每管10滴。
3. 在開始收集洗脫液的同時(shí)檢查蛋白質(zhì)是否已開始流出。為此，由每支收集管中取出1滴溶液置于黑色比色磁盤中，加入1滴20%磺基水楊酸，若呈現(xiàn)白色絮狀沉淀即證明已有蛋白質(zhì)出現(xiàn)，直到檢查不出白色沉淀時(shí)，停止收集洗脫液。
4. 由經(jīng)檢查含有蛋白質(zhì)的每管中，取1滴溶液，放置在白色比色盤孔中，加入1滴奈氏試劑，若呈現(xiàn)棕黃色沉淀說明它含有硫酸銨。合并檢查后不含硫酸銨的各管收集液，即為“脫鹽"后的IgG。
注意：在檢測(cè)時(shí)，用皮頭滴管吸取管中溶液后應(yīng)及時(shí)洗凈，再吸取下一管，以免造成相互污染假象。
實(shí)驗(yàn)材料 蛋白質(zhì)
試劑、試劑盒 膠母液磷酸氫氧化鈉三氯乙酸磺基水楊酸冰醋酸考馬斯亮藍(lán)
儀器、耗材 高壓電泳儀IEF槽離心機(jī)
實(shí)驗(yàn)步驟
一、樣品提取
1. 1 ml 原核表達(dá)細(xì)胞液離心取沉淀。
2. 沉淀用100 μl IEF樣品緩沖液裂解，離心取上清。
二、制膠
1. 安裝超薄膠裝置
2. 依次加入下述試劑
（1）膠母液 2 ml
（2）尿素 8 M/脫氣
（3）NP-40 0.2 ml
（4）兩性電解質(zhì) 2 ml
（5）10%過硫酸胺 50 ul
（6）TEMED 5 ul
3. 倒膠
三、電泳
1. 預(yù)電泳膠凝固后，拆卸制膠裝置，將膠連同支持膜一起置于水平電泳槽上（要求：電泳槽面板上首先被液體石蠟浸潤(rùn)，在凝膠支持膜與電泳槽面板間無氣泡）。
2. 將分別被陰陽極緩沖液浸潤(rùn)的電極條置于膠面上將與陰陽電極接觸的部位 ，蓋上電泳槽罩子，連通電源，200 V 預(yù)電泳10 min。
3. 電泳，將薄棉紙剪成小塊，輕輕置于預(yù)備點(diǎn)樣的膠面上，取10~15 ul 樣品液，點(diǎn)于薄棉紙上，蓋上罩子，連通電源進(jìn)行電泳
4. 電泳參數(shù)：200 V，30 min；400 V，30 min；800 V，4 hr。
四、染色
1. 固定，將電泳完的膠連同支持膜放置于固定液中，10 min。
2. 顯色，50℃下，將膠與支持膜放置于染色液中，顯色，直至條帶出現(xiàn)。
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