實(shí)驗(yàn)方法原理 限制性內(nèi)切酶可識(shí)別特定位點(diǎn)并切割DNA產(chǎn)生粘性末端或平端的外源片段，經(jīng)DNA的純化處理后用于連接反應(yīng)；選擇克隆載體pUC18多克隆位點(diǎn)上相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶切割，并用堿性磷酸酶處理防止載體自連；在連接酶的作用下將外源片段連接到載體上，實(shí)現(xiàn)外源片段的克隆。
實(shí)驗(yàn)材料 DNA片段PUC18
試劑、試劑盒 R.Ebuffer水凝膠氯仿 異戊醇乙醇
儀器、耗材 離心機(jī)
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 載體pUC18和外源DNA片段的限制性酶切：
50 μl反應(yīng)體系，用1.5ml tube，冰上操作）
DNA 30 μl
R.E 1 μl
10×buffer 5 μl
ddH2O 14 μl
外源片段酶切產(chǎn)物和5 μl 37 ℃反應(yīng)1hr，分別取8 μl PUC18酶切產(chǎn)物于1.0%凝膠檢測(cè)酶切是否*；按2－5步純化、回收DNA
2. 加入ddH2O 150 （擴(kuò)大體積），加入等體積氯仿/異戊醇（24:1），顛倒混勻，12000 g離心10 min；
3. 吸取上清，加1/10體積3 M NaAc和兩倍體積無(wú)水乙醇，-20 ℃放置15分鐘以上；
4. 12000 g 4 ℃冷凍離心15分鐘；
5. ddH2O（1.5 ml ddH2O（0.5 ml tube中），PUC18溶于20 μl 倒去上清，用75％乙醇浸洗沉淀，風(fēng)干后外源DNA溶于10 tube中）；
6. 按以下反應(yīng)去除載體PUC18的5’磷酸基團(tuán)，50 ℃反應(yīng)30 min 以上
DNA 20 μl
CIAP（TaKaRa） 0.5 μl
buffer 4.0 ′10 μl
ddH2O 15.5 μl
7. 70 ℃水浴10 min, 使CIAP失活；
8. 按2－5步純化載體，溶于10 μl ddH2O；
9. 連接反應(yīng)
DNA 10 μl
pUC18 2.5 μl
buffer 1.5 ′5 μl
mT4 ligase 3 U/μl
16 ℃水浴過(guò)
10. 轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞
11. 轉(zhuǎn)化子的鑒定
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