免疫熒光染色的主要原理是利用抗原抗體之間的特異性結(jié)合來(lái)顯示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗結(jié)合，其次是帶有熒光基團(tuán)的二抗識(shí)別并結(jié)合一抗，熒光顯微鏡下即可觀察到熒光，下文主要列舉了三種細(xì)胞免疫熒光染色的實(shí)驗(yàn)步驟。
zo-1的免疫熒光，步驟如下：
1、細(xì)胞在蓋片上生長(zhǎng)融合到95%-100%時(shí)，從孵箱中取出。
2、用預(yù)溫的1×PBS洗3次，每次10分鐘
3、4%的甲醛室溫固定20-30分鐘
4、1×PBS洗3次，每次10分鐘
5、0.2%Triton X-100透化2-5分鐘
6、1×PBS洗3次，每次10分鐘
7、5%BSA室溫封閉30分鐘
8、加一抗(用1%BSA稀釋)放在濕盒里，4度過(guò)
9、1×PBS洗3次，每次10分鐘
10、加二抗(用1%BSA稀釋)30分鐘，閉光!!!
11、1×PBS洗3次，每次10分鐘
12、95%甘油封片
注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀釋
從大鼠分離的T細(xì)胞能否直接做細(xì)胞免疫熒光
細(xì)胞爬片的免疫熒光步驟基本一致：
1.取出細(xì)胞爬片放到35mm或60mm用過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)皿里，PBS洗三遍。
注意：有的時(shí)候作的細(xì)胞爬片可能比較小，因此夾取的時(shí)候要小心，注意 反正面，放在皿里洗比較方便，避免了來(lái)回夾取，另外洗的時(shí)候加PBS不要太沖，不要細(xì)胞沖下來(lái)。洗的時(shí)候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，沒(méi)有等5分鐘或10分鐘。
2. 4%冷的多聚甲醛固定20分鐘，PBS洗三遍。
3. 0.2%Triton X-100通透10分鐘，PBS洗三遍。
4. 與二抗相同宿主的血清封閉30分鐘，PBS洗三遍。
5. 一抗4度濕盒內(nèi)過(guò)，也可37度2小時(shí)，感覺(jué)前者效果好，PBS洗三遍。
6.二抗室溫2小時(shí)(避光)，或者37度1半小時(shí)，PBS洗三遍。
7.用DAPI染核，然后直接照熒光片。
8.蒸餾水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因?yàn)楦视筒幌髽?shù)脂那樣會(huì)干，所以不用指甲油封的話會(huì)弄的一塌糊涂。
建議：1.還是染完之后沒(méi)有封片前直接照一些，因?yàn)橛械臅r(shí)候可能封片會(huì)出現(xiàn)問(wèn)題，再想照反而沒(méi)有了，另外不要拖太長(zhǎng)時(shí)間，熒光會(huì)崔滅的。2.熒光的片子一定要避光保存，保存的好的話，過(guò)一段時(shí)間仍然能照出很好的片子。3.二抗用之前一定離心，不然有的時(shí)候有那種沉淀，在片子上就是一個(gè)很大的非特異性熒光光點(diǎn)，非常難看。
細(xì)胞免疫熒光簡(jiǎn)單實(shí)驗(yàn)步驟如下:
1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小時(shí).
2.-20度甲醇固定20分鐘后,自然、干燥 10分鐘
3.PBS洗凈:3min*3
4.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS
5.PBS洗凈:2*5min
6.羊血清封閉：37度，20分鐘
7.一抗，4度過(guò)，一般要大于18小時(shí)或者37度 1-2小時(shí)
8.4度 PBS洗凈，3min*5次
9.二抗 37度小于一小時(shí)
10.37度 PBS洗凈，3*5min
涼干封片(封閉液PH8.5)
不管采用何種方法，在使用PBS緩沖液漂洗時(shí)，都要漂洗干凈并且要測(cè)下pH值，可以使用PBS多清洗幾次，也可以延長(zhǎng)PBS清洗時(shí)間，如果結(jié)果背景較高可以延長(zhǎng)漂洗的次數(shù)和時(shí)間。
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