大腸桿菌表達(dá)蛋白以可溶和不溶兩種形式存在，需要不同的純化策略?，F(xiàn)在，許多蛋白質(zhì)正在被發(fā)現(xiàn)而事先并不知道它們的功能，這些自然需要將蛋白質(zhì)分離出來后，進(jìn)行進(jìn)一步的研究來獲得。分析蛋白質(zhì)的方法學(xué)現(xiàn)已極大的簡化和改進(jìn)。必須承認(rèn)，蛋白質(zhì)純化比起DNA克隆 和操作來是更具有藝術(shù)性的，盡管DNA序列具有異乎尋常的多樣性(因而它是*適合遺傳物質(zhì)的)，但它卻有標(biāo)準(zhǔn)的物理化學(xué)性質(zhì)，而每一種蛋白質(zhì)則有它自己的由氨基酸序列決定的物理化學(xué)性質(zhì)(因而它具有執(zhí)行眾多生物學(xué)功能的用途)。正是蛋白質(zhì)間的這些物理性質(zhì)上的差異使它們得以能進(jìn)行純化但這也意味著需要對每一種待純化的蛋白質(zhì)研發(fā)一套新的方法。所幸的是，盡管存在這種固有的困難，但現(xiàn)已有多種方法可以利用，蛋白質(zhì)純化策略也已實(shí)際可行。目前，待研究蛋白或酶的基因的獲得已是相當(dāng)普遍的事?？烧T導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)特別是Studier等發(fā)展的以噬菌體T7RNA聚合酶為基礎(chǔ)的表達(dá)系統(tǒng)的出現(xiàn)使人們能近乎常規(guī)地獲得過表達(dá)(overexpression)，表達(dá)水平可達(dá)細(xì)胞蛋白的2%以上，有些甚至高達(dá)50%.
(一)試劑準(zhǔn)備
采用T7· Tag Affinity Purification Kit
1. T7·Tag抗體瓊脂 。
2. B/W緩沖液：4.29mM Na2HPO4，1.47 mM KH2PO4，2.7 mM KCl，3. 0.137mM NaCl，1%吐溫-20，pH7.3。
4. 洗脫緩沖液： 0.1M檸檬酸，pH2.2。
5. 中和緩沖液：2M Tris,pH10.4.
6. PEG 20000.
(二)操作步驟
1.100ml 含重組表達(dá)質(zhì)粒 的菌體誘導(dǎo)后，離心5000g×5min，棄上清，收獲菌體，用10ml預(yù)冷的B/W緩沖液重懸。
2. 重懸液于冰上超聲處理，直至樣品不再粘稠，4℃離心 14000g×30min，取上清液，0.45μm膜抽濾后作為樣品液。
3. 將結(jié)合T7·Tag抗體的瓊脂充分懸起，平衡至室溫，裝入層析柱中。
4. B/W緩沖液平衡后樣品液過柱。
5. 10ml B/W緩沖液過柱，洗去未結(jié)合蛋白。
6. 用5ml洗脫緩沖液過柱，每次1ml,洗脫液用含150μl中和緩沖液的離心管收集，混勻后置于冰上，直接SDS-PAGE分析。
7. 將洗脫下來的蛋白放入透析袋中，雙蒸水透析24hr,中間換液數(shù)次。
8. 用PEG 20000濃縮蛋白。
(三)注意事項(xiàng)
蛋白在過層析柱前，要0.45μm膜抽濾，否則幾次純化后，柱子中會有不溶物。
會員1.png)