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技術(shù)文章

免疫PCR實(shí)驗(yàn)步驟

閱讀：1084發(fā)布時(shí)間：2015-11-16

免疫PCR實(shí)驗(yàn)步驟，主要程序

（1） 抗原+*化抗體→抗原-*化抗體復(fù)合物；

（2） 加親合素→抗原-*化抗體-親合素復(fù)合物；

（3） 加*化DNA→抗原-*化抗體-親合素-*化DNA；

（4） PCR擴(kuò)增*化DNA部分。

免疫PCR實(shí)驗(yàn)步驟，實(shí)驗(yàn)步驟

（1）制備*化DNA

將噬粒 BLuescript skt,用*標(biāo)記的M13引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增制備出含T3和T7引物序列的280bp DNa段，即為*化DNA。

（2）免疫PCR模式

1. 試劑

包被緩沖液：20mmol/L Tris-HCI（pH9.5），含150mmol/L NaCl和0.02%NaN3；

洗滌液：20mmol/L Tris-HCI（pH7.5），含150mmol/LNaCl0.1mmol/L EDTA和0.1%Tween20；

稀釋液：20mmol/L Tris-HCI（pH7.5），含150mmol/L NaCl0.45%脫脂奶及變性鮭魚(yú)精DNA （0.1mg/ml）。

免疫PCR實(shí)驗(yàn)步驟，2.操作

（1） 包被

用包被緩沖液稀釋抗原（BSA），加入微滴板中（45μl孔），4℃過(guò)夜（約15h），用洗滌液洗板3次×5min。

（2） 封閉：

每孔加200μl含4.5%脫脂奶及變性鮭魚(yú)精子DNA（1mg/ml）、0.1mmol/L EDTA的20mmol/L Tris-Hcl（pH7.5）（含150mmol/L NaCl緩沖液，37℃溫育80min,洗板數(shù)次。

（3） 抗原抗體反應(yīng)：

用釋釋液1:8000稀釋單克隆抗BSA抗體，每孔加50μl，室溫（22℃）下45min，洗板孔15次×10min，去除未結(jié)合的抗體分子。

（4） 鏈親合一蛋白A結(jié)合反應(yīng)：

每孔加入50μl用稀釋液稀釋的已與*-pUC19結(jié)合的鏈親合素-蛋白A嵌合體，室溫（22℃）50min，使得嵌合體-pUC19結(jié)合于固相的抗原抗體復(fù)合物上，然后洗板15次×10min,再用無(wú)NaN3的TBS洗3次，然后即可將微滴板用于后面的PCR反應(yīng)。

（5） PCR

實(shí)驗(yàn)條件 50mmol/L KCI、10mmol/L Tris-HCI（20℃pH8.3）、1.5mmol/LMgCl2、明膠（10μg/ml）、0.8mmol/LdNTPs（每種0.2mM）、2μM引物（每一引物1μM）和TaqDNA多聚酶（50U/ml）。


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