篩選RNA結(jié)合蛋白實(shí)驗(yàn)，材料與設(shè)備
1. 通過(guò)比較 β-半乳糖苷酶表達(dá)差異導(dǎo)致的細(xì)菌克隆顏色變化檢測(cè)多肽與 RNA 間的作用
(1) 儲(chǔ)存液：氨芐*（100 mg/ml)，*（40 mg/ml，甲醇溶液），X-Gal（40mg/ml，二甲基甲酰胺溶液），IPTG（100 mmol/L），可在 -20℃ 保存數(shù)月。
(2) 蛋白胨培養(yǎng)基：10 g 蛋白胨，5 g NaCl，定容 1 L，滅菌后保存。
(3) 蛋白胨平板：10 g 蛋白胨，5 g NaCl，15 g 瓊脂粉，定容至 1 L，高壓滅菌；冷卻后加入 50 μg/ml氨芐*，15 μg/ml *，80 μg/ml X-Gal，50 μmol/L IPTG。
(4) N-表達(dá)質(zhì)粒（pBR322-衍生的，具氨芐*抗性），N-報(bào)道基因表達(dá)質(zhì)粒 ( pACYCJ84-衍生的，具*抗性）。
(5) E.coil N567 感受態(tài)細(xì)菌，分別含有 N-表達(dá)質(zhì)粒和 N-報(bào)道質(zhì)粒（CaCl2 法制備）。
2. 通過(guò) β-半乳糖苷酶活性檢測(cè)定量比較多肽與 RNA 間的相互作用
(1) 儲(chǔ)存液：1 mol/L 葡萄糖，1 mg/ml 維生素 B1，1 mol/L MgSO4，0.2 μm 濾膜過(guò)濾除菌；4 mg/ml 鄰-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷（Onitrophrny-β-D-garactopyranoside，ONPG）溶解于 A 溶液，4℃ 保存；1 mol/L NaCO3，0.1% SDS，氯仿。
(2) A 溶液：1.5 g K3HPO4，4.5 g KH2PO4，1.0 g (NH4)2SO4，0.5 g 檸檬酸鈉2H2O，加水定容至 1 L，高壓滅菌后保存。
(3) Z 緩沖液：0.06 mol/L Na2HPO4，0.01 mol/L NaH2PO4，0.01 mol/L KCl，0.001 mol/L MgSO4，0.05 mol/L β-巰基乙醇。
篩選RNA結(jié)合蛋白實(shí)驗(yàn)，3. 重組庫(kù)的制備
(1) 儲(chǔ)存液：200 mmol/L DTT ( -20℃ 保存）；2.5 mmol/L dNTP 混合物（-20℃ 保存）；0.5mol/L EDTA，pH 8.0；酚：氯仿：異戊醇（25：24：1 ) 溶液；3 mol/L 乙酸鈉 ( pH 5.2）；50X TAE (242 g Tris 堿，57.1 ml 冰乙酸，100 ml 0.5 mol/L EDTA，加水定容至 1 L）。
(2) 20 μmol/L 含隨機(jī) DNA 序列庫(kù)的簡(jiǎn)并寡核苷酸，末端為固定序列，5' 端和 3' 端分別帶有 NcoⅠ 和 BsmⅠ 酶切位點(diǎn)。
(3) 20 μmol/L 末端與簡(jiǎn)并寡核苷酸 3' 端固定序列互補(bǔ)的引物寡核苷酸。
(4) 酶及公司附帶的緩沖液：NcoⅠ（10 U/μl），BsmⅠ（5 U/μl），測(cè)序酶 2.0（13 U/μl），T4 DNA 連接酶（1 U/μl）。
4. 從隨機(jī)重組庫(kù)中篩選新的 RNA 結(jié)合多肽
(1) N-表達(dá)質(zhì)粒組合文庫(kù)（N-cxpressor plasmid combinatorial library )。
(2) E.coli N567 感受態(tài)（含報(bào)道基因的表達(dá)質(zhì)粒）。
(3) 蛋白胨培養(yǎng)基，平板，氨芐*（100 mg/ml )，*（40 mg/ml )，甲醇溶液。
(4) 滅菌的 96 孔培養(yǎng)板。
篩選RNA結(jié)合蛋白實(shí)驗(yàn)，二、操作方法
1. 通過(guò)比較 β-半乳糖苷酶表達(dá)差異導(dǎo)致的細(xì)菌克隆顏色變化檢測(cè)多肽與 RNA 間的作用
(1) 以 pBR N-表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 N567/pAC 報(bào)道菌：取 10 ng（1~10 μl）的 pBR 質(zhì)粒與 50~100 μl的感受態(tài)報(bào)道菌混勻，冰浴 10 min，37℃ 2 min 后快速轉(zhuǎn)移至冰浴，然后加入 0.5~1 ml 的蛋白胨培養(yǎng)液，37°C 振搖 1 h。
(2) 取 1/5~1/10 的轉(zhuǎn)化混合物涂布于含有抗生素、X-Gal 和 IPTG 的培養(yǎng)板，34℃ 培養(yǎng) 48 h。
(3) 通過(guò)與陽(yáng)性/陰性對(duì)照進(jìn)行顏色比較，采用半定量評(píng)分的方法對(duì)抗轉(zhuǎn)錄終止活性進(jìn)行檢測(cè)：含野牛型 nut 報(bào)道質(zhì)粒而不含N-表達(dá)質(zhì)粒的陰性對(duì)照菌株評(píng)分為 0；同時(shí)含野生型 nut 報(bào)道質(zhì)粒和 N-表達(dá)質(zhì)粒的陽(yáng)性對(duì)照菌株評(píng)分為 + + + + +。
2. 通過(guò) β-半乳糖苷酶活性檢測(cè)定量比較多肽 RNA 間的相互作用
(1) 挑取單個(gè)藍(lán)色的細(xì)菌克隆，用含有相應(yīng)抗生素的蛋白胨培養(yǎng)液 37℃ 培養(yǎng)過(guò)夜。
(2) 稀釋 50 倍過(guò)夜培養(yǎng)物至 3~5 ml 培養(yǎng)液（含 22.4 mmol/L 葡萄糖，1 μg/ml 維生素 B1，1 mmol/L MgSO4 及抗生素）中。37℃ 振搖培養(yǎng)至 OD600 約為 0.2 ( 3~6 h)。加終濃度為 0.5 mmol/L 的 IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)至 OD600 達(dá) 0.4~0.5，測(cè)定并記錄 OD600 值。
(3) 混合 0.1 ml 的細(xì)菌培養(yǎng)物和 0.9 ml 的 Z 緩沖液，并加入 25 μl 的氯仿和 12 μl 的 0.1%SDS，劇烈振蕩 10 s 混勻，此時(shí)溶液應(yīng)變混。10~15 s 后加入的 ONPG 溶液，于 28°C 孵育。
(4) 當(dāng)溶液變黃時(shí)，加入 0.4 ml 1 mol/L NaCO3，終止反應(yīng)。記錄從加入 ONPG 至反應(yīng)終止的時(shí)間。
(5) 于 11000 g 離心 1 min 去沉淀，讀取 OD420 和 OD550 數(shù)值，用公式計(jì)算 β-半乳糖苷酶活性，酶活力=1000X（OD420一1.6XOD550）/（tX0.1XOD600），t=反應(yīng)時(shí)間。
，3. 重組庫(kù)的制備
(1) 取 20 μl 寡核苷酸引物、15 μl 簡(jiǎn)并寡核苷酸、100 μl 測(cè)序酶緩沖液和 272.3 μl 水，混勻。加熱至 65℃ 再緩慢冷至室溫使引物與簡(jiǎn)并寡核苷酸退火。
(2) 再加入 25 μl DTT、60 μl dNTP 混合物、7.7 μl (100 U) 測(cè)序酶，37℃ 孵育 20 min。加入 4μl EDTA 終止反應(yīng)。（在加入測(cè)序酶前留取少量樣品以便通過(guò) 4% 瓊脂糖凝膠電泳與延伸產(chǎn)物比較。）
(3) 加 500 μl 酚：氯仿：異戊醇溶液，劇烈混勻，11000 g 離心 1 min，取上層水相至一干凈離心管內(nèi)；加 500 μl氯仿，劇烈混勻，11000 g 離心 1 min，取上層水相至一干凈離心管。用 1/10 體積的 3 mol/L 乙酸鈉和 2.5倍體積乙醇沉淀 DNA。
(4) 用 290 μl 水，50 μl NEB 緩沖液 2 和 40 μl DTT 溶解 DNA ( 留取少量樣品以便通過(guò) 4%瓊脂糖凝膠電泳與酶切產(chǎn)物比較）。加 40 μl NcoⅠ，37°C 反應(yīng) 2 h ( 留取少量樣品）；加 80 μl BsmⅠ，65℃ 反應(yīng) 2h ( 留取少量樣品）。按前面操作同樣進(jìn)行酚抽提和乙醇沉淀，4% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切程度。
(5) 用 12%、1.6 mm 丙烯酰胺膠分離酶切的 DNA，切下相應(yīng)膠條，用 300 mmol/L 乙酸鈉洗脫 DNA 后用 2.5 倍體積乙醇沉淀。
(6) 對(duì)于 20 μl 體積的連接反應(yīng)，加入 50 ng NcoⅠ和 BsmⅠ消化的質(zhì)粒、5 ng 待插入的 DNA (上一步操作獲得）、1X 連接緩沖液、2 μl T4 DNA 連接酶。將連接混合物轉(zhuǎn)化 N567 菌株。轉(zhuǎn)化菌的接種密度保持在每個(gè)直徑為 100mm 的平板上含 2000~3000 個(gè)克隆。
4. 從隨機(jī)重組庫(kù)中篩選新的 RNA 結(jié)合多肽
(1) 初篩：取制備好的重組庫(kù)（200 μl 的連接產(chǎn)物）加入 1.5 ml 的感受態(tài)報(bào)道細(xì)胞，涂布于直徑為 150 mm的含有抗生素、X-Gal 和 IPTG 的培養(yǎng)板。挑取藍(lán)色克隆（即便是較弱的藍(lán)色克隆也予以挑?。?，分別重懸于 96 孔板內(nèi)（每孔加 100 μl含抗生素的蛋白胨培養(yǎng)液）。細(xì)菌培養(yǎng)過(guò)夜至生長(zhǎng)平臺(tái)期，合并收集細(xì)菌，堿裂解法結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳純化獲取 pBR 質(zhì)粒。
(2) 二次篩選（排除報(bào)道質(zhì)粒自發(fā)突變?cè)斐傻募訇?yáng)性）：將獲得的陽(yáng)性質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化報(bào)道細(xì)胞，涂板篩選，挑取陽(yáng)性克隆接種于 3 ml 含氨芐*的蛋白胨培養(yǎng)液中，過(guò)夜培養(yǎng)至生長(zhǎng)平臺(tái)，分別提取各個(gè)克隆的質(zhì)粒。
(3) 第三次篩選 ( 排除與靶 RNA 非特異結(jié)合造成的假陽(yáng)性）：將獲得的陽(yáng)性質(zhì)粒分別同時(shí)轉(zhuǎn)化含特異性報(bào)道質(zhì)粒的菌株和含非特異性報(bào)道質(zhì)粒的菌株，排除在兩類菌株中都能激活報(bào)道基因的克隆。
(4)第四次篩選（排除表達(dá)質(zhì)粒上隨機(jī)庫(kù)以外的其他部位的堿基突變產(chǎn)生的假陽(yáng)性）：對(duì)第三次篩選得到的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，然后按測(cè)序結(jié)果再合成陽(yáng)性序列，重新克隆人 pBR，再進(jìn)行一次抗轉(zhuǎn)錄終止檢測(cè)。
會(huì)員1.png)