實(shí)驗(yàn)材料 枯草芽孢桿菌168
試劑、試劑盒 SPI 培養(yǎng)基EGTASPII 培養(yǎng)基檸檬酸鈉EGTA氫氧化鈉KH2PO4K2HPO4MgCl2MgSO4葡萄糖酵母膏( NH4 )2SO4
儀器、耗材 培養(yǎng)箱培養(yǎng)皿錐形瓶紫外分光光度計(jì)接種環(huán)離心管
實(shí)驗(yàn)步驟
一、試劑配制
1. SP 鹽
0.2%( NH4 )2SO4，1.4% K2HPO4，0.6% KH2PO4， 0.02% MgSO4·7H2O， 0.1% 檸檬酸鈉。
2. CAYE (100×)
2 % Casamino acid，10%酵母膏。
3. SPI 培養(yǎng)基
SP 鹽溶液加入1 %體積濃度為50%葡萄糖溶液，1 %體積100×CAYE 溶液。
4. SPII 培養(yǎng)基
SPI 培養(yǎng)基加入1 %體積50 mmol/L CaCl2 溶液，1 %體積250 mmol/L MgCl2 溶液。
5. SP-A Salts Solution(500 ml)
（1）0.4% (NH4)2SO4 ：2 g
（2）2.8% K2HPO4·3H2O ：14 g
（3）1.2% KH2PO4 ：6 g
（4）0.2% Trisodium Citrate Dihydrate ：1g
（5）121°C滅菌20 min。
6. SP-B Salts Solution(500 ml)
（1）0.04% MgSO4·7H2O： 0.2 g
（2）121°C滅菌20 min。
7. 100×CAYE Solution(100 ml)
（1）2% Casamino acid ：2 g
（2）10% Yeast Extract：10 g
（3）121°C滅菌20 min。
8. SPI Medium(20 mL)
SP-A Salts Solution：9.8 mL
SP-B Salts Solution：9.8 mL
(1%V)Glucose(50%w/v，115°C滅菌20 min) ：200 μL
(1%V)100×CAYE：200 μL
10. SPII Medium(6 mL)
SPI Medium：5.88mL
(1%V)50mM CaCl2 ：60μL
(1%V)250mM MgCl2：60μL
11. 100×EGTA Solution
10mmol/L EGTA 溶液，溶解時(shí)需加少量NaOH 至pH8.0。
二、實(shí)驗(yàn)步驟
1. 準(zhǔn)備新鮮的168 單克隆平板，取一滿環(huán)枯草芽孢桿菌甘油菌劃LB 平板，37°C 培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。
2. 轉(zhuǎn)化前一天晚間挑單菌落至3 ml LB 培養(yǎng)基中，37°C，250 r/min 培養(yǎng)。
3. 第二天上午取160 μl 培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至8 ml SPI 培養(yǎng)基中，37°C，250 r/min 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期(168 約4-5 h)。
4. 取0.2 ml 生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期末的培養(yǎng)液至2 ml SPII 培養(yǎng)基中，37 °C，100 r/min 培養(yǎng)90 分鐘。
5. 在上述SPII培養(yǎng)基的菌體中加入20 μl 10mmol/L EGTA，再于37°C，100 r/min 培養(yǎng)10 分鐘。
6. 將上述處理后的菌液分裝成0.5 ml 每管，各加入5 μl DNA(DNA 量不能過(guò)高，不超過(guò)5 μg)，再于37 °C，250 r/min 培養(yǎng)90 分鐘，取菌液涂布篩選平板。
收起
注意事項(xiàng)
1. 注意儀器用品的干凈和無(wú)菌。
2. 8ml SPI 培養(yǎng)基要放于50 ml 離心管中培養(yǎng)，以保證菌體的生長(zhǎng)狀態(tài)，不要使用玻璃試管。
3. 注意測(cè)定OD值，一定要等菌體生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期后期。
4. 保證菌體的濃度，可以提高轉(zhuǎn)化率。
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