實(shí)驗(yàn)方法原理 互補(bǔ)的核苷酸序列通過(guò)Walson-Crick堿基配對(duì)形成穩(wěn)定的雜合雙鏈分子DNA分子的過(guò)程稱(chēng)為雜交。雜交過(guò)程是高度特異性的，可以根據(jù)所使用的探針已知序列進(jìn)行特異性的靶序列檢測(cè)。雜交的雙方是所使用探針和要檢測(cè)的核酸。該檢測(cè)對(duì)象可以是克隆化的基因組DNA，也可以是細(xì)胞總DNA或總RNA。根據(jù)使用的方法被檢測(cè)的核酸可以是提純的，也可以在細(xì)胞內(nèi)雜交,即細(xì)胞原位雜交。分子雜交是通過(guò)各種方法將核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性或非放射性標(biāo)記的探針與被固定的模板雜交，經(jīng)顯影或現(xiàn)色后檢測(cè)出目的DNA或RNA 分子所處的位置。
實(shí)驗(yàn)材料 基因組DNAPCR產(chǎn)物
試劑、試劑盒 EcoR l 反應(yīng)bufferTBEDNA landing buffer變性液SSC轉(zhuǎn)移液Washing bufferdetection buffermaleic acid buffer
儀器、耗材 eppendorf 管Tip頭PCR儀無(wú)粉手套水平電泳儀轉(zhuǎn)移槽尼龍膜吸水紙及濾紙
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 基因組DNA限制性?xún)?nèi)切酶酶切
（1）設(shè)置50 ul 反應(yīng)體系，在200 ul EP管中加入：
10 ug 基因組DNA x ul
去離子水 49-x ul
10×buffer 5 ul
EcoR Ⅰ 4 ul
（2）充分混勻，離心20 s。
（3）置于PCR議上37℃反應(yīng)過(guò)。
（4）加1/10體積乙酸鈉、2體積無(wú)水乙醇沉淀DNA晾干。
（5）加20 ul TE buffer溶解DNA。
2. DNA瓊脂糖凝膠電泳
（1）用0.5×TBE buffer配制0.8%瓊脂糖凝膠，微波爐加熱至溶化，加入EB（0.5 ug/ml）混勻后倒入制膠器中室溫凝固。
（2）凝固后，去除樣品梳及膠帶，置于水平電泳儀中。
（3）將DNA樣品用6×DNA landing buffer 混勻后加入樣品孔中，恒壓電泳（20 V/10 mA）直至染料電泳至邊緣。
（4）電泳完畢，取出凝膠切角并在凝膠成像系統(tǒng)成像記錄。
3. DNA轉(zhuǎn)移與固定
（1）凝膠置于0.25 M HCl中處理30 min，去離子水洗1次。
（2）堿變性：凝膠置于0.4 M NaOH變性液中作用20 min。
（3）毛細(xì)管法轉(zhuǎn)移：根據(jù)凝膠大小裁剪與其等大小尼龍膜、濾紙片，尼龍膜一角軟鉛筆作方位標(biāo)記。
（4）去離子水浸泡尼龍膜、濾紙片，中再浸泡5 min。
（5）按下圖安裝轉(zhuǎn)移槽進(jìn)行轉(zhuǎn)移過(guò)（0.4 M NaOH轉(zhuǎn)移液）。
（6）轉(zhuǎn)移完畢后取出尼龍膜，2×SSC浸泡5 min，濾紙吸干，夾在2層干凈濾紙。
4. 預(yù)雜交與雜交
（1）預(yù)雜交：將尼龍膜置于預(yù)熱DIG Easy Hyb工作液（37℃~42℃）中搖晃充分作用30 min。
（2）探針變性：DIG標(biāo)記探針煮沸5 min 后迅速置于碎冰中，用預(yù)熱DIG Easy Hyb工作液制備含探針的雜交液。
（3）棄去預(yù)雜交液，加入雜交液42℃搖動(dòng)孵育4小時(shí)或過(guò)。
（4）2×SSC（in 0.%SDS）洗膜2次（5 min×2），不斷搖動(dòng)。
（5）5×SSC（in 0.%SDS）洗膜2次（155 min×2，65~68℃），期間不斷搖動(dòng)。
5. 雜交檢測(cè)
（1）Washing buffer潤(rùn)洗1遍（3~5 min）。
（2）100 ml blocking buffer工作液封閉30 min。
（3）100 ml antibody buffer（1：5000）孵育30 min。
（4）Washing buffer洗膜（15 min×2）。
（5）20 ml detection buffer 平衡2~5 min。
（6）將尼龍膜置于10 ml color-substrate solution 棕色瓶中，避光數(shù)min至1天（出現(xiàn)顏色時(shí)不要搖動(dòng)）。
（7）當(dāng)出現(xiàn)條帶時(shí)，TE-buffer洗膜（5 min×1），終止現(xiàn)色。
（8）照相記錄，80℃烤干，儲(chǔ)存。
（9）掃描計(jì)算EGFR基因擴(kuò)增的倍數(shù)。
收起
注意事項(xiàng)
1.為了防止緩沖液流從凝膠邊緣之外通過(guò)，沿凝膠的每一邊放置一條 Parafilm膜，使濾紙橋與層疊上部的吸濕材料無(wú)法接觸。
2.核酸轉(zhuǎn)移的選擇尼龍膜比NC膜好，是目前較理想的核酸固相支持膜。
3.尼龍膜漂洗盡量*，可降低背景。
4.color-substrate solution要新鮮配制。
5. Tm = 49.82 + 0.41 （% G + C） - （600/l） [l = length of hybrid in base pairs], Topt. = Tm –20 to 25° C（The given numbers of the equation were calculated according to a standard（The given numbers of the equation were calculated according to a standard equation for hybridization solutions containing formamide, 50%.） The actual hybridization temperature Topt. for hybridization with DIG Easy Hyb is 20-25° C below the calculated Tm value. Topt. can be regarded as a stringent hybridization temperature allows up to 18% mismatches between probe and target. When the degree of homology of your probe to template is less than 80%, you should lower Topt. accordingly （approx. 1.4°C below Tm per 1 % mismatch） and alsoadjust the stringent washing steps accordingly （i.e. increase SSC concentration and lower washing temperature）.
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