限制性核酸內(nèi)切酶及其應(yīng)用 

（一）限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)

    當(dāng)λ(k)噬菌體侵染E.coliB時(shí)，由于其DNA中有EcoB核酸酶特異識(shí)別的堿基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中雖然也存在這種特異序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷*（SAM）將甲基轉(zhuǎn)移給限制酶識(shí)別序列的特定堿基，使之甲基化。 Eco核酸酶不能識(shí)別已甲基化的序列。Bzui早分離出的限制內(nèi)切酶是在1968年，Meselson和Yuan，大腸桿菌B和K菌株，EcoB和EcoK， 是I型的，沒(méi)有實(shí)用價(jià)值。ELISA試劑盒

    *II型限制內(nèi)切酶是在1970年，由H.O.Smith等從Heamophilus influenzae的Rd菌株中Hind II 。使得DNA分子的體外切割成為可能。

    從此，相關(guān)研究展開(kāi)。如NEB公司的提取和克隆。目前已純化出3000種限制性內(nèi)切酶中，其中有30%是在NEB發(fā)現(xiàn)的 。

    限制性核酸內(nèi)切酶（restriction endonuclease ）：是一類能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。切開(kāi)的是3，5－磷酸二酯鍵。

（二）限制性核酸內(nèi)切酶的分類

分為I型、II型和III型。

（三）限制性核酸內(nèi)切酶的命名

1、寄主菌屬名的*個(gè)字母和種名的頭兩個(gè)字母組成3個(gè)斜體

字母的略語(yǔ)表示酶來(lái)源的菌種名稱，如大腸桿菌Escherichia coli 表示為Eco , 流感嗜血菌Haemophilus influenzae 表示為Hin；

2、用一個(gè)正體字母表示菌株的類型，比如EcoR、Hind；

3、如果一種特殊的寄主菌株具有幾個(gè)不同的限制修飾體系，則用羅馬數(shù)字標(biāo)出，比如Eco R I、 Hin。d IIIELISA試劑盒

（四） II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性

1、識(shí)別位點(diǎn)的特異性

每種酶都有其特定的DNA識(shí)別位點(diǎn)，通常是由4～8個(gè)核苷酸組成的特定序列（靶序列）。

2、識(shí)別序列的對(duì)稱性

靶序列通常具有雙重旋轉(zhuǎn)對(duì)稱的結(jié)構(gòu)，即雙鏈的核苷酸順序呈回文結(jié)構(gòu)。

3、切割位點(diǎn)的規(guī)范性

交錯(cuò)切或?qū)ΨQ切（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。

與II型核酸內(nèi)切酶有關(guān)的幾個(gè)概念

粘性末端：cohesive ends是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互補(bǔ)堿基的單鏈延伸末端結(jié)構(gòu)，它們能夠通過(guò)互補(bǔ)堿基間的配對(duì)而重新環(huán)化起來(lái)。

平 末 端 ：Blunt end在識(shí)別序列對(duì)稱處同時(shí)切開(kāi)DNA分子兩條鏈，產(chǎn)生的平齊末端結(jié)構(gòu)。則不易于重新環(huán)化。

同裂酶：isoschizomers 能識(shí)別和切割同樣的核苷酸靶序列的不同來(lái)源的內(nèi)切酶。不同同裂酶對(duì)位點(diǎn)的甲基化敏感性有差別。

同尾酶：isocaudamers 識(shí)別的靶序列不同，但能產(chǎn)生相同粘性末端的一類限制性核酸內(nèi)切酶。如BamH I 、BclI、BglII和Xho I 是一組同尾酶。

注 意： 由同尾酶產(chǎn)生的粘性末端序列很容易重新連接，但是兩種同尾酶消化產(chǎn)生的粘性末端重新連接形成的新片段將不能被該兩種酶的任一種所識(shí)別。

（五）限制性核酸內(nèi)切酶的消化反應(yīng)

一個(gè)限制酶單位（U）指：在理想的反應(yīng)條件（適宜的緩沖液和反應(yīng)溫度，通常為37℃）下，1h內(nèi)中*降解1 mg l DNA所需要的酶量。ELISA試劑盒

影響酶活性的因素很多，zui重要的有：

⑴　DNA的純度

⑵　 DNA的甲基化程度

⑶　酶切反應(yīng)的溫度（通常為37℃ ）

⑷　DNA的分子結(jié)構(gòu)

⑸　 核酸內(nèi)切限制酶的緩沖液

在“非zui適的”反應(yīng)條件下,有些核酸內(nèi)切限制酶識(shí)別序列的特異性便會(huì)發(fā)生“松動(dòng)”，從其“正確”識(shí)別序列以外的其它位點(diǎn)切割DNA分子，這種現(xiàn)象叫星號(hào)活性。用*表示。