質(zhì)粒DNA的小量制備
細(xì)菌的收獲和裂解 收獲 堿裂解法 煮沸裂解 質(zhì)粒DNA小量制備的問(wèn)題與對(duì)策
質(zhì)粒DNA的小量制備可采用下述的堿裂解法或煮沸法
（一）細(xì)菌的收獲和裂解
1．收獲 
1）將2ml含相應(yīng)抗生素的ＬＢ加入到容量為15ml 并通氣良好（不蓋緊）的試管中，然后接入一單菌落，于30℃劇烈振搖下培養(yǎng)過(guò)夜。ELISA試劑盒 
2）將 1.5ml培養(yǎng)物倒入微量離心管中，用微量離心機(jī)于4℃以12000g離心30秒，將剩余的培養(yǎng)物貯存于4℃。 3）吸去培養(yǎng)液，使細(xì)菌沉淀盡可能干燥。除去上清的簡(jiǎn)便方法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連輕緩抽吸，并用吸頭接觸液面。當(dāng)液體從管中吸出時(shí)，盡可能使吸頭遠(yuǎn)離細(xì)菌沉淀，然后繼續(xù)用吸頭通過(guò)抽真空除去附于管壁的液滴。

2．堿裂解法 
1）將細(xì)菌沉淀，所得重懸于100μl用冰預(yù)冷的溶液Ｉ中，劇烈振蕩。 
溶液Ｉ 
50mmol/L葡萄糖 
25mmol/L Tris．Cl(pH8.0) 
10mmol/LEDTA(pH8.0) 
溶液Ｉ可成批配制，每瓶約100ml,在10lbf/in2(6.895×104Pa) 高壓下蒸氣滅菌15分鐘，貯存于4℃。須確使細(xì)菌沉淀在溶液Ｉ中*分散，將兩個(gè)微量離心管的管底部互相接觸震蕩，可使沉淀迅速分散。

2）加200μl新配制的溶液Ⅱ。 
溶液Ⅱ 
0.2mol/L NaOH（臨用前用10mol/L貯存液現(xiàn)用現(xiàn)稀釋?zhuān)?nbsp;
1%SDS 
蓋緊管口，快速顛倒離心管5次，以混合內(nèi)容物。應(yīng)確保離心管的整個(gè)內(nèi)表面 均與溶液Ⅱ接觸。不要振蕩，將離心管放置于冰上。 
3）加 150μl用冰預(yù)冷的溶液Ⅲ 
溶液Ⅲ 
5mol/Ｌ乙酸鉀 
60ml 冰乙酸 
11.5ml 水 28.5ml 
所配成的溶液對(duì)鉀是3mol/L，對(duì)乙酸根是5mol/L。ELISA試劑盒 
蓋緊管口，將管倒置后和地振蕩10秒鐘溶液Ⅲ在粘稠的細(xì)菌裂解物中分散均勻，之后 將管置于冰上3－5分鐘。 
4）用微量離心機(jī)于4℃12 000g離心5分種，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。 
5）可做可不做：加等量酚：氯念， 振蕩混勻， 用微量離心機(jī)于4 ℃以12000g離心 2分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到另一良心管中。有些工作者認(rèn)為不*酚：氯仿進(jìn)行抽提，然而由于一些未知的原因，省略這一步，往往會(huì)得到可耐受限制酶切反應(yīng)的 DNA。 
6）用2倍休積的乙醇于室溫沉淀雙錠DNA。振蕩混合， 于室溫放置2分鐘。 
7）用微量離心機(jī)于4℃以12 000g離心5分鐘。 
8）小心吸去上清液，將離心管倒置于一張紙巾上，以使所有液體流出。再將附于管壁的液滴除盡。除去上清的簡(jiǎn)便方法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連，并用吸頭接觸液面。當(dāng)液體從管中吸出時(shí)，盡量使吸頭遠(yuǎn)離核酸沉淀，然后繼續(xù)用吸頭通過(guò)抽真空除去附于管壁的液滴。 
9）用1ml70%乙醇于4℃洗滌雙鏈DNA沉淀，按步驟8）所術(shù)方法去掉上清，在空氣中使核酸沉淀干燥10分鐘。

i.此法制備的高拷貝數(shù)質(zhì)粒（如Ｘf3或pUC），其產(chǎn)量一般約為：每毫升原細(xì)菌培養(yǎng)物3－5μg。 
ii．如果要通過(guò)限制酶切割反應(yīng)來(lái)分析DNA，可取1μl DNA溶液加到另一含8μl水的微量離心管內(nèi)，加1μl 10×限制酶緩沖液和1單位所需限制酶， 在適宜溫育1－2小時(shí)。將剩余的DNA貯存于－20℃。 
iii.此方法按適當(dāng)比例放大可適用于100ml細(xì)菌培養(yǎng)物：
3．煮沸裂解 
1）將細(xì)菌沉淀，所得重懸于350μlSTET中。 
STET
0.1mol/L NaCL
10mmol/L Tris.Cl(pH8.0) 
1mmol/L EDTA(pH8.0) 
5% Triton X-100 
2）加25μl新配制的*溶液[10mg/ml,用10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)配制]，振蕩3秒鐘以混勻之。如果溶淮中pH低于8.0，*就不能有效發(fā)揮作用。 
3）將離心管放入煮沸的水浴中，時(shí)間恰為40秒。 
4）用微量離心機(jī)于室溫以12 000g離心10分種。 
5）用無(wú)菌牙簽從微量離心管中去除細(xì)菌碎片。 
6）在上清中加入40μl 5mol/L乙酸鈉（pH5.2）和420μl異丙醇，振蕩混勻，于室溫放置5分鐘。 
7）用微量離心機(jī)于4℃以12 000g離心5分種，回收核酸沉淀。 
8）小心吸去上清液，將離心管倒置于一張紙巾上，以使所有液體流出。再將附于管壁的液滴除盡。除去上清的簡(jiǎn)便方法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連，輕緩抽吸，并用吸頭接觸液面。當(dāng)液體從管中吸出時(shí)，盡可能使吸頭遠(yuǎn)離核酸沉淀，然后繼續(xù)用吸頭通過(guò)抽真空除去附于管的液滴。 
9）加1ml 70％乙醇，于4℃以12 000g離心2分鐘。 10）按步驟8）所述再次輕輕地吸去上清，這一步操作要格外小心，因?yàn)橛袝r(shí)沉淀塊貼壁不緊，去除管壁上形成的所有乙醇液滴，打開(kāi)管口，放于室溫直至乙醇揮發(fā)殆盡，管內(nèi)無(wú)可見(jiàn)的液體（2－5）分鐘。 11）用50μl含無(wú)DNA酶的胰RNA酶（20μg/ml）的TE(pH8.0)溶解核酸稍加振蕩，貯存于-20℃。 注：當(dāng)從表達(dá)內(nèi)切核酸酶Ａ的大腸桿菌株（endA+株，如HB101 ）中小量制粒尤其DNA時(shí)，建議舍棄煮沸法。因?yàn)橹蠓胁襟E不能*滅活內(nèi)切核酸酶Ａ，以后在Mg 2+存在下溫育（V中用限制酶時(shí)）質(zhì)粒DNA可被降解。 在上述方案的步驟9）之間增加一步，即用酚：氯仿進(jìn)行抽提，可以避免這一問(wèn)題。

（二）質(zhì)粒DNA小量制備的問(wèn)題與對(duì)策
裂解和煮佛法都極其可靠，重復(fù)性也很好，而且一般沒(méi)有會(huì)么麻煩。多年來(lái)，在我們實(shí)驗(yàn)室中日常使用這兩種方法的過(guò)程中，只碰到過(guò)兩個(gè)問(wèn)題： 
1）有些工作者進(jìn)行小量制備時(shí)，有時(shí)會(huì)發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒DNA不能被限制酶所切割，這幾乎總是由于從細(xì)菌沉淀或從核酸沉淀中去除所有上清液時(shí)注意得不夠。大多數(shù)情況下，用酚：氯仿對(duì)溶液進(jìn)行抽提可以去除小量備物中的雜質(zhì)。如果總是依然存在，可用離心柱層析注純化 DNA。 ELISA試劑盒
2）在十分偶然的情況下，個(gè)別小時(shí)制備物會(huì)出現(xiàn)無(wú)質(zhì)粒DNA的現(xiàn)象。這幾乎肯定是由于核酸沉淀顆粒已同乙醇一起被棄去。