① 是否有效地去除了內(nèi)源性酶和*。應(yīng)注意的是，并不是每一種組織均需要進(jìn)行此步驟，但對于內(nèi)源性酶或*豐富的組織，如肝臟、腎臟等，需考慮此原因。處理的方法為： 滅活堿性磷酸酶：zui常用的方法是將左旋咪唑（24mg/m1）加入底物液中，并保持pH值在7.6~8.2，即能除去大部分內(nèi)源性堿性磷酸酶，對于仍能干擾染色的酸性磷酸酶，可用50mmol/L的酒石酸抑制。

飽和處理內(nèi)源性*：消除內(nèi)源性*的方法是事先滴加親和素，以飽和內(nèi)源性*，使之不再有剩余的結(jié)合位點(diǎn)。具體方法是在ABC法或SP法染色前將切片浸于25ug/ml親和素溶液中處理15分鐘，PBS清洗15分鐘后即可染色。

    ② 是否選擇使用了正確的封閉血清。電荷吸附所造成的非特異性背景染色消除方法是以二抗動(dòng)物的非免疫血清，用PBS稀釋為3%-10%溶液孵育切片，以封閉吸附位點(diǎn)。有時(shí)其它無關(guān)蛋白，如牛血清白蛋白也常應(yīng)用。另外，取材時(shí)避開出血、壞死區(qū)亦極重要。zui近有些國內(nèi)的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用5%脫脂奶粉替代血清進(jìn)行抗原封閉，效果也不錯(cuò)。

    ③ 所選擇的抗體是否符合試驗(yàn)要求。因抗原不純、標(biāo)本片中含有與靶抗原相似的抗原決定簇等原因造成的非特異性染色只能通過采用高純度、價(jià)的抗體、或針對更具特異性抗原決定簇的單克隆抗體來解決。

    ④ 一抗的使用濃度是否過高。

    ⑤ 清洗是否充分。應(yīng)嚴(yán)格操作規(guī)程。因在緩沖液中含有一定量的鹽，這亦有利于減低背景著色，通常0.05mol/l Tris—HCl，0.15mol/l NaCl已適用于多數(shù)染色方法，溶液內(nèi)加入吐溫20，效果更佳。特殊標(biāo)記時(shí)，試劑公司一般都提供緩沖液的配方。

    ⑥ DBA的使用是否正確。DAB的孵育時(shí)間和配制方式可以產(chǎn)生某些背景顏色，使用濃縮型DAB試劑盒時(shí)，請嚴(yán)格按照說明書標(biāo)明的滴加順序操作，注意校正蒸餾水的pH值，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的正確性；粉劑DAB溶解時(shí)，常有一些不溶性顆粒，這些顆粒須經(jīng)過濾除去，否則可能沉積于切片組織上，產(chǎn)生斑點(diǎn)狀著色。另外，DAB保存不妥產(chǎn)生氧化物亦可沉積于切片上，因此需將DAB保存于避光干燥處，現(xiàn)用現(xiàn)配，臨用前加H2O2。孵育時(shí)間過長也會(huì)造成背景染色。

    ⑦ 標(biāo)本染色過程中是否曾經(jīng)干涸，否則會(huì)造成邊緣部的非特異性染色。

    ⑧ 檢查二抗與標(biāo)本的內(nèi)源性組織蛋白是否有交叉反應(yīng)。