使用濃度對熒光PCR結(jié)果的影響：ELISA試劑盒
SYBR Green I 的使用濃度是影響實(shí)驗成功與否的關(guān)鍵因素，如果SYBR Green I的濃度不飽和會使熒光信號不能反應(yīng)產(chǎn)物量的變化。而過高濃度則會抑制PCR反應(yīng)，降低PCR反應(yīng)效率。通常試劑盒會有比較現(xiàn)成的方案。提高鎂離子濃度可以降低SYBR Green I對PCR反應(yīng)的抑制作用。在用SYBR Green I進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)時， 鎂離子濃度要比無SYBR Green I 的普通 PCR 反應(yīng)要高(0.5-2mM)。
 
缺點(diǎn)：
然而雖然SYBR Green熒光染料可以用來監(jiān)測各種雙鏈DNA序列的擴(kuò)增，靈活性高是它的優(yōu)點(diǎn)，但是正如一個硬幣有兩面，通用性高就意味著專一性低，由于熒光染料可以和任何雙鏈DNA結(jié)合，因此DNA引物二聚體(primer-dimers)或其它非特異擴(kuò)增產(chǎn)物(spurious PCR)可以對定量結(jié)果產(chǎn)生干擾(導(dǎo)致低Ct值)，同時也降低了反應(yīng)的專一性和可重復(fù)性---而這一點(diǎn)對于定量PCR分析十分重要。ELISA試劑盒
 
舍不得SYBR Green I的方便、通用、便宜的優(yōu)點(diǎn)，又希望提高其專一性，許多人做了不少嘗試：比如仔細(xì)的設(shè)計引物和純化模板、比如使用能分析產(chǎn)物熔解曲線的軟件可以解決引物二聚體的問題選擇，還有就是采用嚴(yán)格熱啟動的擴(kuò)增酶減少非特異擴(kuò)增、采用特定的緩沖系統(tǒng)減少引物二聚體和錯配形成、采用修飾堿基減少二級結(jié)構(gòu)或者改變穩(wěn)定性、在Tm值以上進(jìn)行熒光測定減少引物二聚體的影響等等。提高PCR的特異性已經(jīng)是老大難問題了，對于貪圖方便、便宜的實(shí)驗新手來說不一定能考慮周全，這也就是為什么許多希望能通過在普通PCR基礎(chǔ)上摸索條件，自己完成定量PCR檢測的研究人員發(fā)現(xiàn)結(jié)果不理想的主要原因之一。因此，不少生物技術(shù)公司針對熒光染料特異性缺點(diǎn)使出了各家的法寶，提出了有建設(shè)性和有新意的解決方案也讓這個熒光檢測技術(shù)繼續(xù)煥發(fā)光彩。ELISA試劑盒