顯色

取出SDS-聚丙烯酰胺凝膠，經(jīng)超純水清洗2次，每次1分鐘，4塊膠分別按4種不同的染色方法顯色。下列每步操作皆在搖床上進行。細胞

4種染色法成份組成及操作如下： ①傳統(tǒng)考馬斯亮藍染色法：清洗后的凝膠經(jīng)固定液(45.4%甲醇、4.6%乙酸)固定1小時，隨后用染色液(45.4%甲醇、4.6%乙酸、0.1% CBB G250)著色過夜，再經(jīng)洗脫液(5%甲醇、7.5%乙酸)過夜脫色至背景清晰。

②膠體考馬斯亮藍染色法(colloidal Coomassie brilliant blue，cCBB)染色法：凝膠先經(jīng)超純水漂洗后，再用colloidal Coomassie blue G250染色液(1.6%磷酸、8%硫酸銨、0.02% CBB G250、20%乙醇)著色過夜，洗脫液為超純水，換液3～4次直至背景清晰。

③改良考馬斯亮藍染色法(modified Coomassie brilliant blue，mCBB)染色法[6];操作方法同膠體考馬斯亮藍染色法，只是染色液組成不同(0.12% CBB G250、10%硫酸銨、10%磷酸、20%乙醇)，著色1小時即可。

④銀染(silver staining)：凝膠漂洗后先被固定液(50%甲醇+ 5%乙酸)固定1小時，隨后分別用50%甲醇和超純水清洗各10分鐘，0.02 mg/L Na2S2O3 致敏1分鐘，超純水清洗2次，每次1分鐘，再用預(yù)冷的0.15% AgNO3著色20分鐘，超純水再次清洗2次，每次1分鐘，2% Na2CO3 + 0.04% 甲醛顯色20～30秒，當溶液變黃以后除去，換新鮮的溶液后繼續(xù)顯色直至顯色適度后，以5%乙酸終止顯色。

成像、分析、質(zhì)譜鑒定

脫色后，凝膠經(jīng)GS-800 Calibrated Densitometer掃描成像，用PDQuest軟件進行分析。切取蛋白質(zhì)點，*消化，行質(zhì)譜鑒定。

結(jié)果

4種染色法的蛋白質(zhì)檢測靈敏性分析

β-半乳糖苷酶的上樣量依次分別為1、0.24、0.062、0.0156和0.004μg。經(jīng)傳統(tǒng)考馬斯亮藍染色后的條帶在62ng水平隱隱可見;而膠體考馬斯亮藍染色法的靈敏度稍高，62ng條帶明顯可見;改良考馬斯亮藍染色法的效果更好些，在15.6ng水平可見條帶的顯示;而銀染法靈敏度zui高，在15.6ng水平可見清晰條帶的顯現(xiàn)，同時在4ng可見隱約條帶。4種染色法的比較顯示，靈敏度zui高的是銀染法，可達納克級水平，其次為改良考馬斯亮藍染色法，10納克級蛋白質(zhì)能被檢測。而膠體考馬斯亮藍染色法和經(jīng)典考馬斯亮藍染色法稍差，檢測水平僅達幾十納克。

4種染色法的雙向電泳蛋白質(zhì)點顯示比較

來自NB4細胞的全蛋白經(jīng)pH 3-10NL的等電點梯度分離，SDS-PAGE 二維垂直電泳后被3種考染法著色成像的顯示可以看出傳統(tǒng)考馬斯亮藍染色法的蛋白質(zhì)點顯現(xiàn)zui少，膠體考馬斯亮藍染色法的蛋白質(zhì)點顯現(xiàn)較多，而改良考馬斯亮藍染色法的蛋白質(zhì)點顯現(xiàn)更多。凝膠背景以后二者為更清晰。經(jīng)PDQuest軟件進行分析，3幅圖的蛋白質(zhì)點顯現(xiàn)數(shù)分別為483、679、890。NB4細胞的全蛋白經(jīng)pH 5-8 IPG分離，分別經(jīng)改良考馬斯亮藍染色法與銀染法著色成像的蛋白點顯示，二者上樣量一致，蛋白點的顯現(xiàn)數(shù)量相當，但銀染的蛋白點明顯顯示著色重。這與單向電泳的效果相同。細胞

4種染色法的可操作性比較

在比較其蛋白質(zhì)檢測靈敏性的同時，對染色法的操作簡便性、安全性以及蛋白質(zhì)經(jīng)質(zhì)譜鑒定的成功率也作了對比。比較顯示，考馬斯亮藍染方法簡便，但耗時較長，經(jīng)改進后可以做到無毒操作，質(zhì)譜兼容性較高。銀染步驟繁多，但耗時短;操作過程中有甲醇、甲醛等毒性物的接觸，質(zhì)譜兼容性低。即使我們選擇的銀染法被文獻報道為質(zhì)譜兼容的，但仍然表現(xiàn)為低的蛋白鑒定率，不及考馬斯亮藍染。