在使用殺傷性武器的時(shí)候，不傷及無辜很重要，對于RNA干涉（RNAi）來說也是如此。RNAi是一種常用的基因失活工具，它的主要缺陷在于會(huì)引起序列特異性的脫靶效應(yīng)。這樣的脫靶效應(yīng)很難預(yù)測，因?yàn)閟iRNA能夠影響與它部分互補(bǔ)的序列，像miRNA那樣抑制基因的表達(dá)。ELISA試劑盒

    要減少脫靶效應(yīng)，可以將針對同一mRNA的不同siRNA混合起來使用。這些siRNA作用于同一個(gè)目標(biāo)，每種siRNA的濃度得以降低，稀釋了各自的脫靶效應(yīng)。然而，這一策略在實(shí)際操作中面臨著兩個(gè)問題。其一，目前“Smart pools"只包括四個(gè)合成的siRNA，復(fù)雜性還不足以顯著減少脫靶效應(yīng)，而合成更多siRNA的成本又太高。其二，利用Dicer或RNase III消化dsRNA時(shí)，siRNA混合物中會(huì)出現(xiàn)長度各異的剪切產(chǎn)物，進(jìn)而引發(fā)許多問題。

    研究人員描述了一種能克服上述問題的新方法。這種被稱為siPools的低成本方法，能夠簡單而的生成含有多達(dá)60種siRNA的混合物，將脫靶效應(yīng)降低到檢出限以下。

    據(jù)介紹，siPools的關(guān)鍵一步是，設(shè)計(jì)針對同一個(gè)基因的幾十種siRNA，并將這些序列結(jié)合到一個(gè)DNA模板上，不同siRNA序列之間以短序列相連。這些模板經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、退火和酶切就能生成成分明確的siRNA混合物。（延伸閱讀：如何優(yōu)化你的RNAi）

    為了驗(yàn)證siPools的效果，研究人員選擇人類基因POLG和SCYL1作為RNAi的靶標(biāo)。之前有研究顯示，針對這兩個(gè)基因的siRNA很容易影響到MAD2基因的表達(dá)，因此它們可以作為檢測脫靶效應(yīng)的理想對象。

    研究人員針對這兩個(gè)基因，分別設(shè)計(jì)了含有60個(gè)siRNA的siPools，然后用它們轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞。研究顯示，在濃度相同的情況下，siPools敲低目標(biāo)基因與單個(gè)siRNA一樣有效。ELISA試劑盒

    這兩個(gè)siPools都含有一個(gè)MAD2脫靶效應(yīng)很強(qiáng)的siRNA。然而在轉(zhuǎn)染之后，MAD2上并未發(fā)生可檢測到的脫靶影響。研究人員隨后又通過螢光素酶報(bào)告基因證實(shí)了這一點(diǎn)。

    此外，研究人員還進(jìn)行了全轉(zhuǎn)錄組的芯片分析。他們發(fā)現(xiàn)，單個(gè)脫靶siRNA除了MAD2以外還大大減少了許多其他的轉(zhuǎn)錄本，但siPools對MAD2和總體轉(zhuǎn)錄本水平都沒有影響。這說明，將大量siRNA混合起來的確能夠大大降低RNAi的脫靶效應(yīng)。下一步，Meister將進(jìn)一步評(píng)估siPools在活體內(nèi)作用效果。

    值得注意的是，研究人員還將siPools成功用于長非編碼RNA（lncRNA）。單個(gè)siRNA往往難以對lncRNA施加影響，這可能是因?yàn)閱蝹€(gè)siRNA難以接觸到高度結(jié)構(gòu)性的lncRNA分子?，F(xiàn)在，研究團(tuán)隊(duì)正在構(gòu)建針對lncRNA的siPool文庫。ELISA試劑盒