主要包括以下4個(gè)基本步驟：樣品制備；電泳分離；蛋白的膜轉(zhuǎn)移；免疫雜交與顯色――蛋白檢測(cè)。

樣品制備

    原始樣品可為細(xì)胞、組織、培養(yǎng)上清、免疫沉淀或親和純化的蛋白，以下為 定性檢測(cè)目的蛋白時(shí)細(xì)胞樣品的處理方法，其余的樣品制備方法參閱相關(guān)文獻(xiàn)。

1.培養(yǎng)細(xì)胞或藥物處理。

2.棄培養(yǎng)基，用1X PBS漂洗細(xì)胞2次，去盡殘留培養(yǎng)基。

3.加入1X SDS樣品緩沖液（6-well plate,100μl /w或 75 cm2 plate,500- 1000μl/瓶） ，刮落細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到Ep管。注意：冰上操作。

4.超聲 10~15秒剪切DNA以減低樣品粘性。

5.煮沸樣品5 minutes。

6.離心12000g，5 min，取上清。

7.電泳分離：上樣15μl~20μl 至 SDS-PAGE 膠 （10 cm x 10 cm）電泳。 如要定量檢測(cè)某蛋白的表達(dá)水平， 應(yīng)用RIPA裂解液（1 ml per 107 cells/100 mm dish/150cm2 flask）裂解細(xì)胞， 收集裂解液至離心管中，在振蕩器上混勻4～15min，14000g離心15min（4℃），棄沉淀，用Bradford法或其它蛋白質(zhì)測(cè)定方法測(cè)定上清中蛋白濃度以調(diào)整上樣體積和上樣量，進(jìn)行

    Western雜交時(shí)還需設(shè)置內(nèi)或外參照，通常用beta-actin。

    注意：一般上樣20~30 μg已足夠，如待檢蛋白為低豐度蛋白，可加大上樣量 至100μg，但電泳條帶易拖尾，可制備亞細(xì)胞組份或采用更敏感的檢測(cè)方法。

電泳分離轉(zhuǎn)膜

    雜交膜的選擇是決定 Western blot成敗的重要環(huán)節(jié)。應(yīng)根據(jù)雜交方案、被轉(zhuǎn) 移蛋白的特性以及分子大小等因素，選擇合適材質(zhì)、孔徑和規(guī)格的雜交膜。用于Western blot的膜主要有兩種：硝酸纖維素膜（NC） 和 PVDF 膜。NC 膜是蛋白印跡實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)固相支持物，在低離子轉(zhuǎn)移緩沖液的環(huán)境下，大多數(shù)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)會(huì)與膜發(fā)生疏水作用而高親和力的結(jié)合在一起， 但在非離子型的去污劑作用 下，結(jié)合的蛋白還可以被洗脫下來。根據(jù)被轉(zhuǎn)移的蛋白分子量大小，選擇不同孔 徑的 NC 膜。因?yàn)殡S著膜孔徑的不斷減小，膜對(duì)低分子量蛋白的結(jié)合就越牢固。 通常用 0.45μ m 和 0.2μm 兩種規(guī)格的 NC 膜。 大于20kD 的蛋白可用 0.45μm 的膜， 小于 20kD的蛋白就要用 0.2μ m 的膜了， 如用0.45μ m 的膜就會(huì)發(fā)生“Blowthrough"的現(xiàn)象。PVDF 膜靈敏度、分辨率和蛋白親和力比常規(guī)的膜要高，非常適合于低 分子量蛋白的檢測(cè)。但 PVDF 膜在使用之前必需用純甲醇浸泡飽和 1-5 秒鐘。

    蛋白質(zhì)常用的轉(zhuǎn)移方法主要有兩種：槽式濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)移。前者操作容易， 轉(zhuǎn)移效率高；而后者適用于大膠的蛋白轉(zhuǎn)移，所用緩沖液少。以下為槽式濕轉(zhuǎn)的操作步驟。

1. 將膠浸于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡 10min。 注意：如檢測(cè)小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白容易擴(kuò)散出膠。

2. 依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6 片， 放入轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10min。 如用P VDF 膜需用純甲醇浸泡飽和 3-5 秒鐘。

3. 裝配轉(zhuǎn)移三明治： 海綿 3 層濾紙 膠 膜 3 層濾紙 海綿， 每層放好后， 用試管趕去氣泡。切記：膠放于負(fù)極面（黑色面）。

4. 將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治（黑色面對(duì)黑色面），加轉(zhuǎn)移緩沖液， 插上電極，100V，1h（電流約為 0.3A）。注意：應(yīng)再次檢查三明治和電極

是否裝配正確，電源是否接通。

5. 轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出雜交膜

免疫雜交與顯色

1.用25 ml TBS 洗膜5min，室溫，搖動(dòng)。

2.置膜于25 ml 封閉緩沖液中1h, 室溫，搖動(dòng)。

3.15mlTBS/T洗3次（5 min/T）。

4.加入合適稀釋度的一抗，室溫孵育1-2h或4°C過夜，緩慢搖動(dòng)。

5.15 ml TBS/T洗3次（5 min/T）。

6.加入合適稀釋度的堿性磷酸酶（AP）或辣根過氧化酶（HRP）標(biāo)記的二 抗，室溫孵育1h，緩慢搖動(dòng)。

7.15 ml TBS/T洗3次（5 min/T）。細(xì)胞

8.15 ml TBS洗1次。

9.蛋白檢測(cè)（ 顯色法或發(fā)光法，按相應(yīng)試劑說明操作） 。