在正常的細(xì)胞有絲分裂過程中，僅S期是DNA合成期。當(dāng)DNA受到損傷時，損傷修復(fù)的DNA合成主要發(fā)生在其他細(xì)胞周期，稱非程序性DNA合成，又稱程序外DNA合成(unsched，aledDNA synthesis，UDS)。因此發(fā)現(xiàn)UDS增高，即表明DNA發(fā)生過損傷。本實驗可用于檢測評價保健食品的誘變性和(或)致癌性。用這種篩選方法可以檢測出一些短期體外實驗法所不能檢出的誘變劑和(或)致癌劑。

    在體外培養(yǎng)細(xì)胞中，UDS水平較低(充其量只有半保留復(fù)制DNA的5％)。可通過同步化培養(yǎng)將細(xì)胞阻斷于Gl期并用藥物(常用*)抑制殘留的半保留DNA復(fù)制后檢測UDS。同步化培養(yǎng)可用缺乏必需氨基酸*的同步化培養(yǎng)基ADM使DNA合成的始動受阻而使細(xì)胞同步于Gl期。在這些半保留DNA合成明顯抑制和阻斷了的細(xì)胞中，UDS即可用3 H一胸腺嘧啶核苷的摻人增加，通過放射自顯影或液體閃爍計數(shù)法進(jìn)行測量。

一、材料與方法

(一)實驗材料

l.受試材料*。

2．待檢樣品及已知對照致癌物。

3．3 H一胸腺嘧啶核苷(5～10μCi／mI，30Ci／mmol)；14C-胸腺嘧啶核苷終濃度為0．0lμCi／ml(50mci／mmol)。

4．細(xì)胞增殖用培養(yǎng)基：

EMEM培養(yǎng)基      85％

胎牛血清      15％

*和*    終濃度分別為100U／ml及100mg／ml

5．同步化培養(yǎng)基：

不含*的EMEM培養(yǎng)基(ADM)   9％

小牛血清     1％

*和*    終濃度分別為100u／ml及100mg／ml

6．Hanks*(HBSS)：

貯液A：

氯化鈉(NaCl)    16．O g

氯化鉀(KCl)   8．0 g

*(MgSO4·7H20)     2．O g

氯化鎂(MgCl2·6H20)    2．O g

    混合后溶于800ml雙蒸水中。另取無水氯化鈣2．8g溶于100ml雙蒸水中。將上述兩溶液混合后，加水至1000ml，加入氯仿2ml，保存于4℃冰箱中。細(xì)胞

貯液B：

*    3．0或1．2 g

(Na2HP04·12H20或Na2HP04·2H2O)

磷酸二氫鉀(KH2PO4)     0．5 g

葡萄糖    20．0 g

氯化鎂(MgCl2·6H20)     2．0 g

混合后溶于800ml雙蒸水中。然后加入100ml 0．4％酚紅溶液(取酚紅1g，溶于3mllmol／L氫氧化鈉中，待*溶解后，加入雙蒸水中至250ml)，加水至1000ml，加入氯仿2ml，保存于4℃冰箱中。

貯液C：1．4％*以雙蒸水配制

應(yīng)用液的配制：取A液1份，B液1份，水18份，混合后分裝于玻璃容器內(nèi)；高壓滅菌，4℃保存。用前加入1．4％*，將pH調(diào)整至7．2～7．4。

7．碳酸緩沖液(無鈣、鎂的Dulbecco氏磷酸緩沖液pH7．4)：

氯化鈉(NaCl)       8．0 g

磷酸二氫鉀(KH2PO4)       0．2 g

氯化鉀(KCl2)       0．2 g

*(Na2HP04·12H2O)      2．9 g

混合后溶于800ml雙蒸水中。待*溶解后，調(diào)節(jié)pH至7．4，加水至1000ml。

8．顯影液及定影液(放射自顯影用)：

Kodak D-196顯影液：水500ml，順次溶入米吐爾(硫酸對甲氨基*)2g，無水亞硫酸鈉72g，對苯二酚8．8g，*48g，*4g，加水至1000ml。停顯液：98％冰乙酸15m1．加水至1000ml。

Kodak F一5定影液：水100ml，依次溶人海波240g，無水亞硫酸鈉15g，28％乙酸48ml，硼酸(結(jié)晶)7．5g，鉀礬15g，加水至1000ml。

9．1mol／L高氯酸：

取70％高氯酸8．57ml，加水至100ml為lmol／L。

10．閃爍液。細(xì)胞

2，5一二苯基嗯唑(PPO)5g，1，4一雙一[5一苯基唔唑基2]一苯(POPOP)300mg溶于甲苯中，使成1000ml。

11．陽性物對照物可用7，12二甲基苯并蒽，2一乙酰氨基芴，4一硝基喹啉氧化物·N甲基亞硝胺。