1) 抗原制備。制備單克隆抗體的免疫抗原，從純度上說(shuō)雖不要求很高，但高純度的抗原使得到所需單抗的機(jī)會(huì)增加，同時(shí)可以減輕篩選的工作量。因此，免疫抗原是越純?cè)胶?，?yīng) 根據(jù)所研究的抗原和實(shí)驗(yàn)室的條件來(lái)決定。一般來(lái)說(shuō)，抗原的來(lái)源有限，或性質(zhì)不穩(wěn)定，提純時(shí)易變性，或其免疫原性很強(qiáng)，或所需單抗是用于抗原不同組分的純化 或分析等，免疫用的抗原只需初步提純甚至不提純，但抗原中混雜物很多，特別是如果這些混雜物的免疫原性較強(qiáng)時(shí)，則必須對(duì)抗原進(jìn)行純化。檢測(cè)用抗原可以是與 免疫抗原純度相同，也可是不同的純度，這主要決定于所用篩檢方法的種類(lèi)及其特異性和敏感性。

    (2) 免疫動(dòng)物的選擇。根據(jù)所用的骨髓瘤細(xì)胞可選用小鼠和大鼠作為免疫動(dòng)物。因?yàn)?，所有的供雜交瘤技術(shù)用的小鼠骨髓瘤細(xì)胞系均來(lái)源于BALB/c小鼠，所有的大鼠骨髓瘤細(xì)胞都來(lái) 源于LOU/c大鼠，所以一般的雜交瘤生產(chǎn)都是用這兩種純系動(dòng)物作為免疫動(dòng)物。但是，有時(shí)為了特殊目的而需進(jìn)行種間雜交，則可免疫其他動(dòng)物。種間雜交瘤一 般分泌抗體的能力不穩(wěn)定，因?yàn)槿旧w容易丟失。就小鼠而言，初次免疫時(shí)以8-12周齡為宜，雌性鼠較便于操作。
(3) 免疫程序的確定。免疫是單抗制備過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)之一，其目的在于使B淋巴細(xì)胞在特異抗原刺激下分化、增殖，以利于細(xì)胞融合形成雜交細(xì)胞，并增加獲得分泌特異性抗體的雜交 瘤的機(jī)會(huì)。因此在設(shè)計(jì)免疫程序時(shí)，應(yīng)考慮到抗原的性質(zhì)和純度、抗原量、免疫途徑、免疫次數(shù)與間隔時(shí)間、佐劑的應(yīng)用及動(dòng)物對(duì)該抗原的應(yīng)答能力等。沒(méi)有一個(gè)免 疫程序能適用于各種抗原?，F(xiàn)用的免疫程序中多數(shù)是參照制備常規(guī)多克隆抗體的方法。表6-1列舉了目前常用的免疫程序。免疫途徑常用體內(nèi)免疫法包括皮下注 射、腹腔或靜脈注射，也采用足墊、皮內(nèi)、滴鼻或點(diǎn)眼。zui后一次加強(qiáng)免疫多采用腹腔或靜脈注射，目前尤其推崇后者，因?yàn)榭墒箍乖瓕?duì)脾細(xì)胞作用更迅速而充分。 在zui后一次加強(qiáng)免疫后第3天取脾融合為好，許多實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果表明，初次免疫和再次免疫應(yīng)答反應(yīng)中，取脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，特異性雜交瘤的形成高峰分別為第4天和第22天，在初次免疫應(yīng)答時(shí)獲得的雜交瘤主要分泌IgM抗體，再次免疫應(yīng)答時(shí)獲得的雜交瘤主要分泌IgG抗 體。筆者體會(huì)陽(yáng)性雜交瘤出現(xiàn)的高峰與小鼠血清抗體的滴度并無(wú)明顯的平行關(guān)系，且多在血清抗體高峰之前。因此，為達(dá)到zui高的雜交瘤形成率需要有盡可能多的漿 母細(xì)胞，這在zui后一次加強(qiáng)免疫后第3天取脾進(jìn)行融合較適宜。已有人報(bào)道采用脾內(nèi)免疫，可提高小鼠對(duì)抗原的免疫反應(yīng)性，且節(jié)省時(shí)間，一般免疫3天后即可融合。

細(xì)胞融合

    首先制備細(xì)胞培養(yǎng)基、 氨基喋呤（A）貯存液、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷（HT）貯存液等各種細(xì)胞生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。然后制備髓瘤細(xì)胞和脾淋巴細(xì)胞，之后進(jìn)行細(xì)胞融合。在細(xì)胞融合后選擇性培養(yǎng)過(guò)程中，由于大量骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞相繼死亡，此時(shí)單個(gè)或少數(shù)分散的雜交瘤細(xì)胞多半不易存活，通常必須加入其他活細(xì)胞使之繁殖，這 種被加入的活細(xì)胞稱(chēng)為飼養(yǎng)細(xì)胞。飼養(yǎng)細(xì)胞促進(jìn)其他細(xì)胞增殖的機(jī)制尚不明了，一般認(rèn)為它們可能釋放非種屬特異性的生刺激因子，為雜交瘤細(xì)胞提供必要的生長(zhǎng) 條件；也可能是為了滿(mǎn)足新生雜交瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞密度的依賴(lài)性。

雜交瘤細(xì)胞篩選

    雜交瘤細(xì)胞在融合后2周左右即可篩選，即把分泌所需抗體的雜交瘤孔從眾多的孔中選出來(lái)，通常也稱(chēng)為抗體檢測(cè)?？贵w檢測(cè)的方法很多，通常根據(jù)所研究的抗原和 實(shí)驗(yàn)室的條件而定。但作為雜交瘤篩選的抗體檢測(cè)方法必須具有快速、準(zhǔn)備、簡(jiǎn)便，便于一次處理大量樣品等特點(diǎn)。因?yàn)橥袔装賯€(gè)樣品需要在短短幾個(gè)小時(shí)就報(bào) 告結(jié)果，以便決定雜交瘤細(xì)胞的取舍。所以選用抗體檢測(cè)方法的原則是快速、敏感、特異、可靠、花費(fèi)小和節(jié)省人力。一般說(shuō)來(lái)，在融合之前就必須建立好抗體檢測(cè) 方法，并克服可能存在的問(wèn)題。另一個(gè)重要問(wèn)題是抗
    體檢測(cè)方法所需要的“動(dòng)力學(xué)范圍”，即檢出背景以上的zui強(qiáng)與zui弱信號(hào)之比，依所用的檢測(cè)抗原是否純凈而 定。如雜交瘤抗體是針對(duì)純化的蛋白質(zhì)抗原的，100%的抗原參與反應(yīng)，一個(gè)陽(yáng)性/陰性判別系統(tǒng)就夠了。另一方面，如果雜交瘤抗體是針對(duì)細(xì)胞表面微量的蛋白 抗原，檢測(cè)系統(tǒng)可能需要能測(cè)出微弱信號(hào)，則動(dòng)力學(xué)范圍至少應(yīng)為10：1，為100：1。另外，檢測(cè)方法的選擇還受所需雜交瘤抗體的類(lèi)型和預(yù)定的用途的 影響。結(jié)合補(bǔ)體的抗體可以用基于細(xì)胞毒性反應(yīng)的檢測(cè)方法來(lái)選出。如需結(jié)合A蛋白的雜交瘤抗體，就要用結(jié)合蛋白A的檢測(cè)方法。