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細胞培養(yǎng)方法

時間：2016/5/23閱讀：1709

初代組織塊培養(yǎng)法
1.剪切：把組織小塊置于小燒杯或小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸靜Hanks液，用眼科剪反復(fù)剪切1mm3塊為止。
2.擺布：用彎頭吸管吸取若干小塊，置于培養(yǎng)瓶中，用吸管彎頭把組織小塊擺布在培養(yǎng)瓶底部，小塊相互距離以0.5cm為宜，每一25ml培養(yǎng)瓶底可擺布20~30塊。
3.輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，另瓶底向上，注意翻瓶時勿另組織小塊流動，塞好瓶塞，置36.5℃溫箱培養(yǎng)2小時左右（勿超過4小時），使小塊微干涸。
4.培養(yǎng)：從微箱中取出培養(yǎng)瓶，開塞，46度斜持培養(yǎng)瓶，箱瓶底腳部輕輕注入培養(yǎng)液少許，然后緩緩再把培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)過來，讓培養(yǎng)液慢慢覆蓋附于瓶地上的組織小塊。置溫箱中靜止培養(yǎng)。待細胞從組織塊游出數(shù)量增多后。再補加培養(yǎng)液。
傳代培養(yǎng)法
原理
細胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后，已基本上飽和，為使細胞能繼續(xù)生長，同時
也將細胞數(shù)量擴大，就必須進行傳代（再培養(yǎng)）。傳代培養(yǎng)也是一種將細胞種保存下去的方法。同時也是利用培養(yǎng)細胞進行各種實驗的必經(jīng)過程。懸浮型細胞直接分瓶就可以，而貼壁細胞需經(jīng)消化后才能分瓶。
材料和試劑
1.細胞：貼壁細胞株
2.試劑：0.25％、1640培養(yǎng)基（含10％小牛血清）
3.儀器和器材：倒置顯微鏡，培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶、吸管、廢液缸等
操作步驟
1.吸除培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。
2.向瓶內(nèi)加入和EDTA混合液少許，以能覆滿瓶底為限。
3.置溫箱中2~5分鐘，當發(fā)現(xiàn)細胞質(zhì)回縮，細胞間隙增大后，立即終止消化。
4.吸除消化液，向瓶內(nèi)注入Hanks液數(shù)毫升，輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶，把殘余消化液沖掉。注意加Hanks液沖洗細胞時，動作要輕，以免把已松動的細胞沖掉流失，如用液單獨消化，吸除液后，可不用Hanks液沖洗，直接加入培養(yǎng)液。
5.用吸管吸取營養(yǎng)液輕輕反復(fù)吹打瓶壁細胞，使之從瓶壁脫離形成細胞懸液。
6.計數(shù)板計數(shù)后，把細胞懸液分成等份分裝入數(shù)個培養(yǎng)瓶中，置溫箱中培養(yǎng)。
無菌操作注意事項
1.操作前要洗手，進入超凈臺后手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試。
2.點燃酒精燈，操作在火焰附近進行，耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼，金屬器械燒灼時間不能太長，以免退火，并冷卻后才能夾取組織，吸取過營養(yǎng)液的用具不能再燒灼，以免燒焦形成碳膜。
3.操作動作要準確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動，增加污染機會。
4.不能用手觸已消毒器皿的工作部分，工作臺面上用品要布局合理。
5.瓶子開口后要盡量保持45℃斜位。
6.吸溶液的吸管等不能混用

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