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錯配修復(fù)基因檢測細(xì)胞衰老

時間:2016/8/8閱讀:1254
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錯配修復(fù)基因超家族屬于管家基因,目前已發(fā)現(xiàn)人類6個錯配修復(fù)基因:hMSH2、hMSH3、hMSH6、hMLH1、hPMS1和hPMS2。錯配修復(fù)基因的異常表現(xiàn)為基因突變和蛋白質(zhì)表達(dá)的減步,而蛋白質(zhì)表達(dá)涉及RNA水平和蛋白質(zhì)水平。下面就RNA水平作一簡要闡述。

錯配修復(fù)基因mRNA原位雜交:

【材料】

蓋玻片、濕盒、雜交爐、PBS、SSC、預(yù)雜交液、BcIP/NBT。

【操作程序】

1.將細(xì)胞制成1~107/L細(xì)胞懸液,將細(xì)胞懸液一滴接種于已消毒培養(yǎng)皿中的蓋玻片上,加培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時。

2.將細(xì)胞生長狀態(tài)良好的蓋玻片取出0.01mol/L PBS漂洗3次,甲醇:丙酮(1:1)固定液固定10分鐘,PBS漂洗3次。

3.將制好的細(xì)胞片用10mg/ml蛋白酶K消化,37℃,10分鐘,PBS洗2次,每次2分鐘。

4.取200μl預(yù)雜交液95℃變性10分鐘,冰浴中驟冷,加樣于細(xì)胞標(biāo)本上.平放入密封濕盒.42℃孵育3小時。

5.標(biāo)記探針加于200μl預(yù)雜交液中,95℃變性10分鐘,冰浴中驟冷,加樣于細(xì)胞標(biāo)本上,平放入密封濕盒,42℃恒溫過夜。

6.依次用6 xSSC-45%甲酰胺洗10分鐘,2×SSC洗10分鐘×2次,0.2xSSC洗10分鐘×2次。

7.加堿性磷酸酶標(biāo)記的抗體,37℃,4小時。

8.洗脫液洗10分鐘,加入BCIP/NBT顯色。鏡檢顯況,PBS沖洗,終止顯色。

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