赤羽?。ˋD）ELISA試劑盒說明
本試劑盒僅供研究使用。
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使用目的：
本試劑盒用于測定牛血清、血漿及相關(guān)液體樣本中赤羽病（AD）表達。
實驗原理
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中牛赤羽病（AD）表達。用純化的牛赤羽病（AD）抗
體包被微孔板，制成固相抗體，可與樣品中赤羽?。ˋD）相結(jié)合，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的抗
原和其他成分后再與HRP 標(biāo)記的赤羽?。ˋD）抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，
經(jīng)過*洗滌后加底物TMB 顯色。TMB 在HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下
轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），與CUTOFF 值相比較，
從而判定標(biāo)本中牛赤羽病（AD）的存在與否。
試劑盒組成
1 30 倍濃縮洗滌液20ml×1 瓶7 終止液6ml×1 瓶
2 酶標(biāo)試劑6ml×1 瓶8 陽性對照0.5ml×1 瓶
3 酶標(biāo)包被板12 孔×8 條9 陰性對照0.5ml×1 瓶
4 樣品稀釋液6ml×1 瓶10 說明書1 份
5 顯色劑A 液6ml×1 瓶11 封板膜2 張
6 顯色劑B 液6ml×1/瓶12 密封袋1 個
標(biāo)本要求
1．標(biāo)本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能
馬上進行試驗，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融
2．不能檢測含NaN3 的樣品，因NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
操作步驟
1. 編號：將樣品對應(yīng)微孔按序編號，每板應(yīng)設(shè)陰性對照2 孔、陽性對照2 孔、空白對照1
孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）
2. 加樣：分別在陰、陽性對照孔中加入陰性對照、陽性對照50µl。然后在待測樣品孔先
加樣品稀釋液40µl，然后再加待測樣品10µl。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不
觸及孔壁，輕輕晃動混勻，
3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30 分鐘。
4. 配液：將30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水30 倍稀釋后備用
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 秒后棄去，如此
重復(fù)5 次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50µl，空白孔除外。
7. 溫育：操作同3。
8. 洗滌：操作同5。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50µl，再加入顯色劑B50µl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色
15 分鐘.
10. 終止：每孔加終止液50µl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。
11. 測定：以空白空調(diào)零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。測定應(yīng)在加終止
液后15 分鐘以內(nèi)進行。
計算和結(jié)果判定：
試驗有效性：陽性對照孔平均值≥1.00; 陰性對照平均值≤0.10
臨界值（CUT OFF）計算：臨界值=陰性對照孔平均值+0.15
陰性判定：樣品OD 值< 臨界值（CUT OFF）者為牛赤羽?。ˋD）陰性
陽性判定：樣品OD 值≥ 臨界值（CUT OFF）者為牛赤羽病（AD）陽性
。
注意事項
1．操作嚴(yán)格按照說明書進行，本試劑不同批號組分不得混用。
2．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30 分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未
用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。
3．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。
4．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
5．底物請避光保存。
6．試驗結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)，使用雙波長檢測時，參考波長為630nm
7．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。終止液為2M 的硫酸，使用時必須
注意安全。
保存條件及有效期
1．試劑盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6 個月