targetingsystems(targeting systems)DLAR-4

Cypridina-Renilla 熒光素酶的雙重檢測

描述：

基于單一溶液的雙熒光素酶檢測試劑：

節(jié)省篩選應用的成本和時間

已開發(fā)出一組改進的超靈敏分泌型熒光素酶報告基因，以分析同一組轉染細胞中的兩種不同啟動子活性。這種方法還使人們能夠在不殺死細胞的情況下實時研究反應，因為這三個報告基因是分泌的。Targeting Systems 提供了許多不同的細胞內和分泌型雙熒光素酶檢測試劑。Cycpridina -Gaussia 螢光素酶檢測系統(tǒng)特別有吸引力，因為 Cypridina 螢光素酶和 Gaussia 螢光素酶在細胞內和分泌部分都具有強大的活性，并且在使用該試劑進行檢測時都具有穩(wěn)定的生物發(fā)光信號。Renilla 熒光素酶生物發(fā)光信號的穩(wěn)定性（圖 2）。

Cypridina (Vargula) 螢光素酶：來自海洋介形魚 Vargula Hilgendorfi 的 Cypridina 螢光素酶（以前稱為 Vargula 螢光素酶）是一種分泌型螢光素酶，最大發(fā)射波長為 460 nm。它是已知的最亮的熒光素酶之一，具有最高的轉化率。

高斯熒光素酶：Gaussia Luciferase 是一種來自海洋橈足類 Gaussia Princeps (1,2) 的熒光素酶。這種不需要 ATP 的熒光素酶在產生光的反應中催化底物腔腸素的氧化，并且與其他發(fā)光報告基因相比具有相當大的優(yōu)勢，例如可分泌性和更亮的信號強度，以及出色的生物發(fā)光信號穩(wěn)定性。大約 10% 在一小時內衰減。從用表達 GLuc 的質粒轉染的培養(yǎng)細胞的上清液中測得的發(fā)光與產生的酶量成正比，這反過來又反映了轉錄水平。或者，細胞裂解物可用于盡管大部分活性是分泌的，但 Gaussia 熒光素酶的高靈敏度也允許從細胞裂解物中進行測量。

生物發(fā)光信號和發(fā)射光譜的穩(wěn)定性

圖A



圖B

DLAR-4 targetingsystems  

圖2： 使用熒光素酶測定試劑在DLAR-4系統(tǒng)中的不同熒光素酶報告熒光素酶活性的動力學：建立反應以測量轉染細胞樣品中不同熒光素酶的熒光素酶活性的動力學。使用 DLAR-4 熒光素酶測定試劑測定熒光素酶活性。圖 A：使用 DLAR-4 雙檢測系統(tǒng)的 VLAR 組件時 Cypridina 熒光素酶生物發(fā)光信號的穩(wěn)定性。圖 B：使用 GAR-2 試劑和穩(wěn)定劑時 GLuc 生物發(fā)光信號的穩(wěn)定性。該試劑適用于需要檢測大量樣品的 HTS 應用。在沒有穩(wěn)定劑的情況下，信號強度最初略高，但比有穩(wěn)定劑時衰減得更快。注意：顯示的數(shù)據是在 Turner TD2020 光度計上測量的三次重復測定的平均值。

好處：

Cypridina Luciferase 和 Gaussia luciferas 在轉染細胞的上清液和裂解物中都具有非常強的信號。因此可用作雙分泌型報告基因或雙胞內報告基因。

天然 Cypridina (Vargula) 熒光素酶和 Gaussia 熒光素酶具有天然分泌信號，并且在表達后有效分泌到細胞培養(yǎng)基中。檢測熒光素酶不需要細胞裂解

Cypridinaia 螢光素酶是已知最亮的螢光素酶之一，與常用的螢火蟲螢光素酶相比，它具有最高的轉換數(shù)和更高的生物發(fā)光信號強度，使其成為理想的轉錄報告基因 (1)。

Gaussia 螢光素酶檢測系統(tǒng)的穩(wěn)定劑成分在更長的時間內提供穩(wěn)定的動力學，讓用戶有時間進行高通量分析以及手動交付的檢測。

分泌的 Cypridina luciferas 蛋白是穩(wěn)定的，并且在產光方面具有*的活性，因此可以進行非常靈敏的檢測 (1,2)。

含有 VLuc 和分泌型海腎熒光素酶（即轉染后的生長培養(yǎng)基或細胞裂解物）的樣品可以在 -20°C 下長期保存。

Cypridina-Gaussia Luciferase Dual Assay Reagent-DLAR-4

套件內容：

100x 腔腸素

儲存于 -20°C

Gaussia 熒光素酶測定稀釋緩沖液 - 4°C 保存

Gaussia 熒光素酶測定 (GAR) 穩(wěn)定劑 - 4°C 保存

100x Cypridina Luciferin 底物 -儲存于 -80°C

Cypridina 底物稀釋緩沖液 - 4°C 保存

VLAR 緩沖液（Cypridina 熒光素酶檢測緩沖液）- 4°C 保存

Cypridina (Vargula) 熒光素酶檢測緩沖液 - 4°C 保存

協(xié)議：

細胞上清液檢測：

Gaussia 螢光素酶檢測

用所需量的 Gaussia 熒光素酶測定稀釋緩沖液將 100X 腔腸素稀釋至 1X（每次測定需要 50 ul 稀釋試劑）。

將 5-20 µl 含有 Gaussia 熒光素酶或 Cypridina 熒光素酶的樣品移入每個孔或光度計管中進行檢測

向每個樣品中添加 8 ul GAR 穩(wěn)定劑（這是可選的，如果省略穩(wěn)定劑，則會獲得更高但不太穩(wěn)定的信號。

向每個樣品中加入 50 ul Gaussia 熒光素酶檢測試劑（按步驟 1 所述制備）。混合均勻并在光度計中讀取。

Cypridina (Vargula) 熒光素酶測定

用 Cypridina (Vargula) 底物稀釋緩沖液將 10 µl Vargulin 底物稀釋至 1 ml。

將 5-20 µl 含有 Gaussia 熒光素酶或 Cypridina 熒光素酶的樣品移入每個孔或光度計管中進行檢測

向每個樣品中加入 40 ul VLAR 檢測緩沖液。

將 20 ul 稀釋的 Cypridina 熒光素底物（Vargulin）按步驟 1 中所述制備，添加到每個樣品中?；旌暇鶆虿⒃诠舛扔嬛凶x取。

細胞裂解物中螢光素酶活性的測定： GAR 或 VLAR 螢光素酶測定試劑也可用于測量預裂解細胞中的螢光素酶活性。注意：如果您需要測量細胞內熒光素酶活性，請先使用 Targeting Systems 的細胞裂解緩沖液裂解細胞。（目錄號 5X CLR-01）

用水稀釋 5X CLR 緩沖液 1:5。

吸出細胞培養(yǎng)基并用無血清 DMEM 洗滌細胞兩次。

添加足夠的 1X 細胞裂解緩沖液以覆蓋細胞。添加足夠的裂解緩沖液以覆蓋 cell.s（96 孔為 50 ul，12 孔為 300 ul，6 孔培養(yǎng)皿為 800 ul，10 cm 培養(yǎng)皿為 3 ml

在定軌振蕩器（室溫）上以 400 rpm 的速度搖動 20 分鐘。

將 5-20 µl 含有熒光素酶的樣品或細胞裂解物與 100 µl 熒光素酶檢測試劑盒 (TS-1) 混合，并立即在光度計中讀數(shù)。

所有測定試劑在測定時應接近室溫。

參考：

Yamagishi, K.、Enomoto, T. 和 Ohmiya, Y. (2006) Anal。生物化學，354，15-21。

Wu, C.、Suzuki-Ogoh, C. 和 Ohmiya, Y. (2007) Biotechniques, 42, 290-292。

Elisa Michelini、Luca Cevenini、Laura Mezzanotte、Danielle Ablamsky、Tara Southworth、Bruce Branchini 和 Aldo Roda* (2007) 用于多重生物發(fā)光和高內涵篩選的光譜解析基因技術。肛悶?；瘜W，10.1021/ac7016579 S0003-2700(70)01657-8

4) BR Branchini、TL Southworth、JP DeAngelis、A Roda 和 E Michelini (2006) 來自意大利螢火蟲 Luciola italica 的熒光素酶：分子克隆和表達。Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol，2006 年 10 月；145（2）：159-67。

4) BR Branchini、DM Ablamsky、MH Murtiashaw、L Uzasci、H Fraga 和 TL Southworth (2007) 用于生物發(fā)光報告基因應用的耐熱紅光和綠光螢火蟲熒光素酶突變體。肛悶生物化學，2007 年 2 月：361(2)：253-62。