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上海酶聯(lián)生物研究所
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上海酶聯(lián)生物研究所
閱讀：4305發(fā)布時(shí)間：2010-4-19
蛋白質(zhì)沉淀的概念：
蛋白質(zhì)分子凝聚從溶液中析出的現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)沉淀（precipitation），變性蛋白質(zhì)一般易于沉淀，但也可不變性而使蛋白質(zhì)沉淀，在一定條件下，變性的蛋白質(zhì)也可不發(fā)生沉淀。
定性分析：
蛋白質(zhì)所形成的親水膠體顆粒具有兩種穩(wěn)定因素，即顆粒表面的水化層和電荷。若無外加條件，不致互相凝集。然而除掉這兩個(gè)穩(wěn)定因素（如調(diào)節(jié)溶液pH至等電點(diǎn)和加入脫水劑）蛋白質(zhì)便容易凝集析出。如將蛋白質(zhì)溶液pH調(diào)節(jié)到等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)分子呈等電狀態(tài)，雖然分子間同性電荷相互排斥作用消失了。但是還有水化膜起保護(hù)作用，一般不致于發(fā)生凝聚作用，如果這時(shí)再加入某種脫水劑，除去蛋白質(zhì)分子的水化膜，則蛋白質(zhì)分子就會(huì)互相凝聚而析出沉淀；反之，若先使蛋白質(zhì)脫水，然后再調(diào)節(jié)pH到等電點(diǎn)，也同樣可使蛋白質(zhì)沉淀析出。
沉淀方法：
1.鹽析法——多用于各種蛋白質(zhì)和酶的分離純化；
在蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽以破壞蛋白質(zhì)的膠體穩(wěn)定性而使其析出，這種方法稱為鹽析。常用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等。各種蛋白質(zhì)鹽析時(shí)所需的鹽濃度及pH不同，故可用于對(duì)混和蛋白質(zhì)組分的分離。例如用半飽和的硫酸銨來沉淀出血清中的球蛋白，飽和硫酸銨可以使血清中的白蛋白、球蛋白都沉淀出來，鹽析沉淀的蛋白質(zhì)，經(jīng)透析除鹽，仍保證蛋白質(zhì)的活性。調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液的pH至等電點(diǎn)后，再用鹽析法則蛋白質(zhì)沉淀的效果更好。鹽析法分為兩類，*類叫Ks分段鹽析法，在一定PH和溫度下通過改變離子強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)，用于早期的粗提液；第二種叫b分段鹽析法，在一定離子強(qiáng)度下通過改變PH和溫度來實(shí)現(xiàn)，用于后期進(jìn)一步分離純化和結(jié)晶。影響鹽析的因素包括：蛋白質(zhì)濃度、離子強(qiáng)度和類型、PH值、溫度等。針對(duì)溫度這一條，需要強(qiáng)調(diào)：在低離子強(qiáng)度或純水中，蛋白質(zhì)溶解度在一定范圍內(nèi)隨溫度增加而增加。但在高濃度下，蛋白質(zhì)、酶和多肽類物質(zhì)的溶解度隨溫度上升而下降。在一般情況下，蛋白質(zhì)對(duì)鹽析溫度無特殊要求，可在室溫下進(jìn)行，只有某些對(duì)溫度比較敏感的酶要求在0-4℃進(jìn)行。
使用硫酸銨沉淀蛋白需要注意：硫酸銨中常含有少量的重金屬離子，對(duì)蛋白質(zhì)巰基有敏感作用，使用前必須用H2S處理：將硫酸銨配成濃溶液，通入H2S飽和，放置過夜，用濾紙除去重金屬離子，濃縮結(jié)晶，100℃烘干后使用。另外，高濃度的硫酸銨溶液一般呈酸性（PH=5.0左右），使用前也需要用氨水或硫酸調(diào)節(jié)至所需PH。
2.有機(jī)溶劑沉淀法——多用于生物小分子、多糖及核酸產(chǎn)品的分離純化；
有機(jī)溶劑的沉淀機(jī)理是降低水的介電常數(shù)，導(dǎo)致具有表面水層的生物大分子脫水，相互聚集，zui后析出。該法優(yōu)點(diǎn)在于：1）分辨能力比鹽析法高，即蛋白質(zhì)或其它溶劑只在一個(gè)比較窄的有機(jī)溶劑濃度下沉淀；2）沉淀不用脫鹽，過濾較為容易；3）在生化制備中應(yīng)用比鹽析法廣泛。但是，在常溫下，有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)往往引起變性。例如酒精消毒滅菌就是如此。因此，操作要求在低溫下進(jìn)行。有機(jī)溶劑的選擇首先是能和水混溶，使用較多的有機(jī)溶劑是乙醇、甲醇、丙酮，還有二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、乙腈和2-甲基-2,4戊二醇等。
3.等電點(diǎn)沉淀法——此法單獨(dú)應(yīng)用較少，多與其它方法結(jié)合使用；
兩性電解質(zhì)分子上的凈電荷為零時(shí)溶解度zui低，不同的兩性電解質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)，以此為基礎(chǔ)可進(jìn)行分離。如工業(yè)上生產(chǎn)胰島素時(shí)，在粗提液中先調(diào)PH8.0去除堿性蛋白質(zhì)，再調(diào)PH3.0去除酸性蛋白質(zhì)。利用等電點(diǎn)除雜蛋白時(shí)必須了解制備物對(duì)酸堿的穩(wěn)定性，不然盲目使用十分危險(xiǎn)。不少蛋白質(zhì)與金屬離子結(jié)合后，等電點(diǎn)會(huì)發(fā)生偏移，故溶液中含有金屬離子時(shí)，必須注意調(diào)整PH值。等電點(diǎn)法常與鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法或其他沉淀方法聯(lián)合使用，以提高其沉淀能力。
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