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上海酶聯(lián)生物研究所
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實(shí)踐出真知，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)的金丹總結(jié)了多個(gè)細(xì)胞的消化經(jīng)驗(yàn)，對(duì)*消化方法進(jìn)行了改進(jìn)。
背景：對(duì)于絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的用作模型的細(xì)胞來(lái)說(shuō)，細(xì)胞傳代是一項(xiàng)*的工作，常用的傳代方法為：向長(zhǎng)滿了細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中加入足量*浸泡消化細(xì)胞一段時(shí)間后再分散細(xì)胞并傳代。但是各種細(xì)胞對(duì)*的敏感度千差萬(wàn)別，有的細(xì)胞比如HEK293系列的極容易消化，而有些如RAW264.7幾乎不能被*從瓶壁上消化下來(lái)。消化時(shí)間不夠，后續(xù)的細(xì)胞分散就需要用機(jī)械力，這樣對(duì)細(xì)胞損傷太大，而且往往達(dá)不到很好的效果；消化過(guò)度，則會(huì)引起某些敏感的細(xì)胞的死亡，對(duì)于廣大新手來(lái)說(shuō)，在培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)*的消化程度很難把握。
方法改進(jìn)：
1. *消化：細(xì)胞長(zhǎng)滿后，棄培養(yǎng)基，用無(wú)菌PBS或者0.25%的*溶液適量浸洗細(xì)胞一次，浸洗的目的是去除生活藏培養(yǎng)基中的血清等抑制*活性的物質(zhì)，洗完后棄凈洗液，再次用0.25%的*溶液潤(rùn)洗一次，洗完后小心丟棄洗液，此時(shí)瓶?jī)?nèi)還會(huì)殘留很少的*溶液，蓋好細(xì)胞瓶塞，放入培養(yǎng)箱進(jìn)行消化直到對(duì)光可見(jiàn)明顯的細(xì)胞間隙增大，瓶?jī)?nèi)變圓細(xì)胞開(kāi)始整體脫落，此時(shí)加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基終止消化，后續(xù)輕微用移液器吹打即可很好的分散細(xì)胞。
2. 有些實(shí)驗(yàn)室采用添加EDTA的方法增加*的消化能力，但是添加的EDTA會(huì)大量螯合體系中的二價(jià)離子，如Ca2+，如此會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞尤為環(huán)境及胞內(nèi)離子的大量流失，容易對(duì)細(xì)胞照成更大的損傷。因此，本人改進(jìn)的方法中不使用添加EDTA的*消化液。
3. 對(duì)于本身貼壁不牢但是又容易聚集生長(zhǎng)的細(xì)胞，典型的例子就是HEK293,方法可以改進(jìn)為：采用上述殘液消化，但是在放入37度培養(yǎng)箱消化時(shí)培養(yǎng)瓶倒置，適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間（HEK293:5-8min）；因?yàn)闊o(wú)論是直接倒出還是用吸管吸，培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)殘留的*還是很多，這類細(xì)胞極易從瓶壁上大塊脫落后，在*溶液里面形成團(tuán)狀，極難被消化分散。
4. 對(duì)RAW264.7這類極難用*消化的細(xì)胞，可采用的改進(jìn)方法如下：第二次用*浸洗時(shí)延長(zhǎng)時(shí)間至5-10min，之后倒出*，剩余殘液繼續(xù)放回培養(yǎng)箱中進(jìn)行消化10-15min，此時(shí)細(xì)胞可很容易的被吹打分散均勻。
結(jié)果：本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)了COS7,HEK293,NIH3T3,HepG2,RAW264.7以及原代細(xì)胞等多種生長(zhǎng)特性的細(xì)胞，從貼壁不牢固的COS7,HEK293等細(xì)胞到一般用細(xì)胞刮刀傳代的RAW264.7,現(xiàn)在基本都采用這種傳代方法，在傳代培養(yǎng)是可以獲得很好的單細(xì)胞懸液，對(duì)細(xì)胞的損害也比以前的方法（浸泡消化，添加EDTA）小很多，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。
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