上世紀(jì)70年代初，在遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)、微生物學(xué)等學(xué)科發(fā)展的基礎(chǔ)上，出現(xiàn)基因工程，后又被稱為重組DNA技術(shù)。這項技術(shù)為任何一種生物接受另一種生物的遺傳物質(zhì)并在其細(xì)胞內(nèi)表達(dá)功能和穩(wěn)定遺傳提供了可能性，也為我們在試管 內(nèi)直接操作遺傳物質(zhì)改變基因功能、調(diào)節(jié)基因表達(dá)方式創(chuàng)造了條件。經(jīng)過近40年的發(fā)展，基因工程技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)各個學(xué)科的基礎(chǔ)研究，成為微觀生物學(xué)，甚至宏觀生物學(xué)有力的研究手段。這項技術(shù)也在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品、化工和環(huán)保等領(lǐng)域結(jié)出了豐碩的應(yīng)用成果。在基因工程技術(shù)的基礎(chǔ)上已出現(xiàn)了蛋白質(zhì)工程、基因治療、DNA藥物和新一代的代謝工程等多個生物技術(shù)生長點，展現(xiàn)出越來越廣闊的應(yīng)用前景[1]。
基因工程技術(shù)的核心是基因表達(dá)技術(shù)。至今，人們已建立了許多基因表達(dá)系統(tǒng)，既有原核生物基因表達(dá)系統(tǒng)，也有真核生物基因表達(dá)系統(tǒng)。不同的表達(dá)系統(tǒng)特點不同，有它們的優(yōu)勢，也有它們的不足。另外，由于研究深度的差異，它們的成熟程度和應(yīng)用范圍也很不一樣。
1.大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)
在各種表達(dá)系統(tǒng)中，zui早被采用進(jìn)行研究的是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，也是目前掌握zui為成熟的表達(dá)系統(tǒng)。其主要方法是將已克隆入目的基因DNA片段的載體 （一般為質(zhì)粒）轉(zhuǎn)化細(xì)菌（通常選用的是大腸桿菌），通過IPTG等誘導(dǎo)并zui終純化獲得所需的目的蛋白。
對于表達(dá)不同的蛋白，需要采用不同的載體。目前已知的大腸桿菌的表達(dá)載體可分為非融合型表達(dá)載體和融合型表達(dá)載體兩種。非融合表達(dá)是將外源基因插到表達(dá)載體強啟動子和有效核糖體結(jié)合位點序列下游，以外源基因mRNA的AUG為起始翻譯，表達(dá)產(chǎn)物在序列上與天然的目的蛋白一致。融合表達(dá)是將目的蛋白或多膚與另一個蛋白質(zhì)或多肽片段的DNA序列融合并在菌體內(nèi)表達(dá)。融合型表達(dá)的載體包括分泌表達(dá)載體、帶純化標(biāo)簽的表達(dá)載體、表面呈現(xiàn)表達(dá)載體、帶伴侶的表達(dá)載體[2]。
作為發(fā)展zui早、目前應(yīng)用zui廣泛的經(jīng)典表達(dá)系統(tǒng)，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)點在于遺傳背景清楚、繁殖快、成本低、表達(dá)量高、表達(dá)產(chǎn)物容易純化、穩(wěn)定性好、抗污染能力強以及適用
范圍廣等[3]。但與此同時原核表達(dá)系統(tǒng)還存在許多難以克服的缺點：如目的蛋白常以包涵體形式表達(dá)，導(dǎo)致產(chǎn)物純化困難；而且原核表達(dá)系統(tǒng)翻譯后加工修飾體系不完善，表達(dá)產(chǎn)物的生物活性較低。
2. 酵母表達(dá)系統(tǒng)
酵母表達(dá)系統(tǒng)作為一種后起的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，由于兼具原核以及真核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點，正在基因工程領(lǐng)域中得到日益廣泛的應(yīng)用。zui早應(yīng)用于基因工程的酵母是釀酒酵母。釀酒酵母（Saecharomycesc erevisiae）在釀酒業(yè)和面包業(yè)的使用已有數(shù)千年的歷史，被認(rèn)為是GRAS （generally recognized as safe）生物，不產(chǎn)生毒素，完整的基因序列也于1996年完成測序[4]，長期廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)，已被美國FDA確認(rèn)為安全性生物，其表達(dá)產(chǎn)物不需經(jīng)過大量的宿主安全性實驗。但與新型酵母體系相比，釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)存在不適合高密度培養(yǎng)、缺乏強有力的嚴(yán)格調(diào)控的啟動子，而且分泌效率較低，尤其是許多分子量大于30kD的外源蛋白幾乎不分泌等缺點，通常不被看作是重組蛋白的理想宿主。
后來人們又相繼開發(fā)了裂殖酵母、甲醇酵母等。其中，甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用zui廣泛的酵母表達(dá)系統(tǒng)。目前甲醇酵母主要有H Polymorpha，Candida Bodini，Pichia Pastris 3種，并以Pichia Pastoris應(yīng)用zui多。甲醇酵母的表達(dá)載體為整合型質(zhì)粒，載體中含有與酵母染色體中同源的序列，因而比較容易整合入酵母染色體中。大部分甲醇酵母的表達(dá)載體中都含有甲醇酵母醇氧化酶 基因—1（AOX1），在該基因的啟動子（PAOX1）作用下，外源基因得以表達(dá)。PAOX1是一個強啟動子，在以葡萄糖或甘油為碳源時。甲醇酵母中AOX1基因的表達(dá)受到抑制，而在以甲醇為*碳源時PAOX1可被誘導(dǎo)激活，因而外源基因可在其控制下表達(dá),將目的基因多拷貝整合入酵母染色體后可以提高外源蛋白的表達(dá)水平及產(chǎn)量[5]。此外甲醇酵母的表達(dá)載體都為E.coli／Pichia Pastoris的穿梭載體，其中含有E.coli復(fù)制起點和篩選標(biāo)志，可在獲得克隆后采用E.coli細(xì)胞大量擴(kuò)增。甲醇酵母一般先在含甘油的培養(yǎng)基中生長。培養(yǎng)至高濃度。再以甲醇為碳源。誘導(dǎo)表達(dá)外源蛋白。這樣可以大大提高表達(dá)產(chǎn)量。利用甲醇酵母表達(dá)外源性蛋白質(zhì)其產(chǎn)量往往可達(dá)克級。與釀酒酵母相比其翻譯后的加工更接近哺乳動物細(xì)胞，不會發(fā)生超糖基化。
3. 昆蟲表達(dá)系統(tǒng)
昆蟲表達(dá)系統(tǒng)是一類應(yīng)用廣泛的真核表達(dá)系統(tǒng)，它具有同大多數(shù)高等真核生物相似的翻譯后修飾加工以及轉(zhuǎn)移外源蛋白的能力。利用重組桿狀病毒在昆蟲細(xì)胞體系中表達(dá)外源蛋白
是目前較為流行的表達(dá)方式，其表達(dá)的蛋白水平高達(dá)1~500mg/L，但受到諸多因素的限制和影響，如培養(yǎng)基質(zhì)量、供氧情況、保證對數(shù)生長等[3]。
桿狀病毒是已知昆蟲病毒中zui大的類群，是發(fā)現(xiàn)zui早、研究zui多且適用意義很大的昆蟲病毒。桿狀病毒的基因組為單一閉合環(huán)狀雙鏈DNA分子，大小為80~160 kb，其基因組可在昆蟲細(xì)胞核復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。DNA復(fù)制后組裝在桿狀病毒的核衣內(nèi)，后者具有較大的柔韌性，可容納較大片段的外源DNA插入，因此是表達(dá)大片段DNA的理想載體[6]。另外，此系統(tǒng)所用的多角體蛋白啟動子，是一個很強的真核生物啟動子。常用的桿狀病毒包括苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒（AcNPV）和家蠶型多角體病毒（BmNPV），常用的宿主細(xì)胞則來源于草地夜蛾Sf9細(xì)胞，用于表達(dá)外源基因的質(zhì)粒來源于PUC系列，其含有一個多克隆位點和多角體蛋白啟動子。桿狀病毒系統(tǒng)的主要有點包括①重組蛋白具有完整的生物學(xué)功能，如蛋白的正確折疊、二硫鍵的搭配；②蛋白翻譯后的加工修飾；③表達(dá)水平高，可達(dá)總蛋白 量的50%；④可容納大分子的插入片段；⑤能同時表達(dá)多個基因。主要缺點是外源蛋白表達(dá)處于極晚期病毒啟動子的調(diào)控之下，這時由于病毒感染，細(xì)胞開始死亡[7]。
4. 哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)
哺乳動物細(xì)胞表達(dá)外源重組蛋白可利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和病毒載體的感染。利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞需幾周甚至幾個月時間，而利用病毒表達(dá)系統(tǒng)則可快速感染細(xì)胞，在幾天內(nèi)使外源基因整合到病毒載體中，尤其適用于從大量表達(dá)產(chǎn)物中檢測出目的蛋白。哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體必須包含原核序列、啟動子、增強子、選擇標(biāo)記基因、終止子和多聚核苷酸 信號等控制元件[3]。
根據(jù)目的蛋白表達(dá)的時空差異，可將表達(dá)系統(tǒng)分為瞬時、穩(wěn)定和誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。瞬時表達(dá)系統(tǒng)是指宿主細(xì)胞在導(dǎo)入表達(dá)載體后不經(jīng)選擇培養(yǎng)，載體DNA隨細(xì)胞分裂而逐漸丟失，目的蛋白的表達(dá)時限短暫；瞬時表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點是簡捷，實驗周期短。穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)是指載體進(jìn)入宿主細(xì)胞并經(jīng)選擇培養(yǎng)，載體DNA穩(wěn)定存在于細(xì)胞內(nèi)，目的蛋白的表達(dá)持久、穩(wěn)定。由于需抗性選擇甚至加壓擴(kuò)增等步驟，穩(wěn)定表達(dá)相對耗時耗力。誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)是指目的基因的轉(zhuǎn)錄受外源小分子誘導(dǎo)后才得以開放。采用異源啟動子、增強子和可擴(kuò)增的遺傳標(biāo)記，可提高蛋白產(chǎn)量[8]。
哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)在蛋白的起始信號、加工、分泌、糖基化方面具有*優(yōu)勢，適合表達(dá)完整的大分子蛋白。由哺乳動物細(xì)胞翻譯后再加工修飾產(chǎn)生的外源蛋白質(zhì)，在活性方面遠(yuǎn)勝于原核表達(dá)系統(tǒng)及酵母、昆蟲細(xì)胞等真核表達(dá)系統(tǒng)，更接近于天然蛋白質(zhì)，但構(gòu)成復(fù)雜、
操作技術(shù)要求高、表達(dá)產(chǎn)量不大、產(chǎn)率低，且有時會導(dǎo)致病毒感染等是該表達(dá)系統(tǒng)的不足之處。
5. 植物表達(dá)系統(tǒng)
植物能夠表達(dá)來自動物、細(xì)菌、病毒以及植物本身的蛋白質(zhì)易于大規(guī)模培養(yǎng)和生產(chǎn)，且在基因表達(dá)與修飾及安全性方面有特別的優(yōu)勢，因此利用植物生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)的研究展現(xiàn)了極其誘人的前景。多種抗體、酶、激紊、血漿蛋白和疫苗等都已通過基因工程的手段在植物的葉、莖、根、果實、種子以及植物細(xì)胞和器官中得到表達(dá)，然而提取與純化始終是大規(guī)模利用植物生產(chǎn)重組蛋白的主要障礙。Doloressa等[9]據(jù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號肚在蛋白質(zhì)合成中的作用，把3種重組蛋白，即嗜熱細(xì)菌來源的木聚糖酶、水母的綠色熒光蛋白和人胎盤分泌的堿性磷酸酶 （SEAP）定位到質(zhì)外體中，通過根分泌和葉分泌途徑獲得表達(dá)，從而建立了兩種新的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)——植物根分泌和葉分泌，簡化了分離和純化程序，為利用轉(zhuǎn)基因植物大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白提供了潛在的途徑。雖然利用植物表達(dá)、生產(chǎn)外源性蛋白起步較晚，但目前已經(jīng)能夠利用植物生產(chǎn)多種醫(yī)用、食用以及工業(yè)用蛋白及酶制劑。
總之，各種表達(dá)系統(tǒng)各有其優(yōu)缺點，大腸桿菌和酵母表達(dá)系統(tǒng)蛋白表達(dá)水平高，生產(chǎn)成本低，但它們的加工修飾體系與昆蟲細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞不*相同；哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)更接近于天然蛋白質(zhì)，但其表達(dá)量低、操作繁瑣。各種表達(dá)系統(tǒng)由于翻譯后的加工不*相同，因而產(chǎn)生的重組蛋白的生物學(xué)活性和免疫原性有時會有差別。因此，選擇表達(dá)系統(tǒng)時，必須充分考慮各種因素，如所需要表達(dá)的蛋白是否有毒性，是否有活性，是否需要糖基化，還需要考慮成本、產(chǎn)量及純化路線和安全性，權(quán)衡利弊后在研究工作積累和實踐探索的基礎(chǔ)上，做出謹(jǐn)慎的判斷和選擇。
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