鑒定細(xì)胞死活的方法有哪些

活細(xì)胞的鑒定在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)上具有很重要的意義。細(xì)胞培養(yǎng)過程中要隨時(shí)記錄細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，需要經(jīng)常測(cè)定細(xì)胞的存活率；在腫瘤細(xì)胞的研究中，為了檢驗(yàn)各種藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力，也需要測(cè)定腫瘤細(xì)胞的存活率。在臨床醫(yī)學(xué)中死活細(xì)胞的鑒定也有很大的應(yīng)用，例如為了檢測(cè)某一男子的生育能力，測(cè)定精子細(xì)胞的存活力是比較常用的辦法。

死活細(xì)胞的鑒定方法有很多種，常用的有染色法和儀器分析法。染色法是常用的細(xì)胞死活鑒定方法，簡(jiǎn)便，易于操作。但是通過直接的形態(tài)觀察來鑒別細(xì)胞死活，實(shí)驗(yàn)結(jié)果很容易受操作者的主觀因素的影響，存在一定的誤差，所以，在實(shí)際操作中也常采用一些儀器來進(jìn)行的批量檢測(cè)。

不同的死活細(xì)胞鑒定方法有各自不同具體的反應(yīng)機(jī)理，但無論采用何種辦法，都是利用了死活細(xì)胞在生理機(jī)能和性質(zhì)上的差異。

常用的方法包括染色法和儀器分析法。

1 染色法

染色法分化學(xué)染色法和熒光染色法，根據(jù)染色機(jī)理的不同，染料或使死細(xì)胞著色，或使活細(xì)胞著色。死活細(xì)胞在生理機(jī)能和性質(zhì)上的差異主要包括：

死活細(xì)胞細(xì)胞膜通透性的差異：活細(xì)胞的細(xì)胞膜是一種選擇性膜，對(duì)細(xì)胞起保護(hù)和屏障作用，只允許物質(zhì)選擇性的通過；而細(xì)胞死亡之后，細(xì)胞膜受損，通透性增加。常用的以臺(tái)盼藍(lán)鑒別細(xì)胞死活的方法就是利用了這一性質(zhì)。臺(tái)盼藍(lán)，又稱錐藍(lán)，是一種陰離子型染料，不能透過完整的細(xì)胞膜。所以經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色后只能使死細(xì)胞著色，而活細(xì)胞不被著色。甲基藍(lán)有類似的染色機(jī)理。植物細(xì)胞的質(zhì)壁分離也可鑒定死活。

死活細(xì)胞在代謝上的差異：是采用美藍(lán)染料鑒定酵母細(xì)胞死活的依據(jù)。美藍(lán)是一種無毒染料，氧化型為藍(lán)色，還原型為無色。由于活細(xì)胞中新陳代謝的作用，使細(xì)胞內(nèi)具有較強(qiáng)的還原能力，能使美藍(lán)從藍(lán)色的氧化性變?yōu)闊o色的還原型，因此美藍(lán)染色后活的酵母細(xì)胞無色；而死細(xì)胞或代謝緩慢的老細(xì)胞，則因它們的無還原能力或還原能力極弱，使美藍(lán)處于氧化態(tài)，從而被染成藍(lán)色或淡藍(lán)色。

熒光素雙醋酸酯（FDA）是一種常用的培養(yǎng)動(dòng)植物細(xì)胞以及植物細(xì)胞原生質(zhì)體的生活力鑒定染料，其染色機(jī)理也利用了死活細(xì)胞在代謝上的差異：FDA本身不產(chǎn)生熒光，也無極性，能自由滲透出入完整的細(xì)胞膜。當(dāng)FDA進(jìn)入活細(xì)胞后，被細(xì)胞內(nèi)的脂酶分解，生成有極性的、能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)——熒光素，該物質(zhì)不能自由透過活的細(xì)胞膜，積累在細(xì)胞膜內(nèi)，因而使有活力的細(xì)胞產(chǎn)生綠色熒光；而無活力的細(xì)胞因不能使FDA分解，而無法產(chǎn)生熒光。

除此之外，還有一些細(xì)胞器的專有染料。如液泡系的專有染料中性紅。中性紅是一種低毒性染料，可以使活細(xì)胞液泡著紅色，而細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核不被著色；死細(xì)胞的液泡不被著色或淺染，染料彌散于整個(gè)細(xì)胞中，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)被染成紅色。有時(shí)侯為了增加染色效果可以將兩種染料結(jié)合使用，如甲基藍(lán)-中性紅混合染色法。

2 儀器分析法

可采用微電極技術(shù)（利用死活細(xì)胞膜兩側(cè)電位的差異）、全自動(dòng)分析細(xì)胞記數(shù)儀和流式細(xì)胞儀等，可對(duì)細(xì)胞的死活進(jìn)行的批量檢測(cè)。

德國(guó)INNOVATIS出產(chǎn)的全自動(dòng)Cedex細(xì)胞存活率/細(xì)胞計(jì)數(shù)儀/細(xì)胞分析儀是 世界上*臺(tái)高分辨率、高清晰度掃描（）細(xì)胞分析儀，具有全自動(dòng)臺(tái)盼藍(lán)染色、顯微CCD成象、CEDEX工作站軟件，可用于制藥、醫(yī)學(xué)、發(fā)酵、免疫、 病理、毒性測(cè)試、生物技術(shù)等學(xué)科的研究開發(fā)和工業(yè)生產(chǎn)過程中的細(xì)胞計(jì)數(shù)和分析。自動(dòng)分析結(jié)果，檢測(cè)分析數(shù)據(jù)輸出（11項(xiàng)）：總細(xì)胞數(shù)目，總細(xì)胞濃度 （cells/mL） ；活細(xì)胞數(shù)目，活細(xì)胞濃度 （cells/mL）；死細(xì)胞數(shù)目，死細(xì)胞濃度 （cells/mL） ；細(xì)胞存活率 （%） ；細(xì)胞的平均圓度 （compactness） ；細(xì)胞的平均直徑 （um） ；細(xì)胞團(tuán)比例 （Aggregate Rate）；細(xì)胞直徑分布圖 （Diameter Histogram）；細(xì)胞團(tuán)分布圖 （Aggregate Histogram）；細(xì)胞圓度分布圖 （Compactness Histogram） ；細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)間曲線（C*tion Time Chart）。

流式細(xì)胞儀法 用來判斷細(xì)胞死活的常用熒光探針有二大類：一類是能透過活的細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)而發(fā)出熒光的物質(zhì)，例如FDA可被活細(xì)胞持留而發(fā)出黃綠色熒光，若細(xì)胞有損傷 則會(huì)從細(xì)胞中流失，觀察不到熒光。另一類是不能透過活細(xì)胞膜，但能對(duì)固定的細(xì)胞及膜有破損的細(xì)胞的核進(jìn)行染色，例如碘化丙啶（ PI,Propidium iodide ）和溴化乙錠（ EB,Ethidium bromide ）就是常用的第二類熒光探針。碘化丙啶（PI）不能穿透細(xì)胞膜，對(duì)于具有完整細(xì)胞膜的正常細(xì)胞或凋亡細(xì)胞不能染色。而對(duì)于壞死細(xì)胞，其細(xì)胞膜的完整性喪 失，碘化丙啶（PI）可以染色壞死細(xì)胞。目前常用的一種細(xì)胞凋亡與壞死檢測(cè)試劑盒則含有Hoechst 33342和碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）兩種熒光染料。細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，染色質(zhì)會(huì)固縮，Hoechst 33342可以穿透細(xì)胞膜，染色后凋亡細(xì)胞熒光會(huì)比正常細(xì)胞明顯增強(qiáng)。上述兩種染料雙染后，使用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡檢測(cè)時(shí)，正常細(xì)胞為弱紅色熒光＋弱 藍(lán)色熒光，凋亡細(xì)胞為弱紅色熒光＋強(qiáng)藍(lán)色熒光，壞死細(xì)胞為強(qiáng)紅色熒光＋強(qiáng)藍(lán)色熒光。