原代細胞培養(yǎng)成功以后,需要進行分離培養(yǎng),否則細胞會因生存空間不足或密度過大,營養(yǎng)障礙,影響細胞生長。細胞由原培養(yǎng)瓶內(nèi)分離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的過程稱之為傳代培養(yǎng)。傳代細胞允許培養(yǎng)的細胞擴增(形成細胞株),可以進行細胞克隆,易于保存,但可能喪失一些特殊的細胞和分化特征。傳代細胞形成細胞株的zui大利處在于提供了大量持久的實驗材料,便于實驗。
1. 操作步驟
(1)吸掉或倒掉培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。
(2)向瓶內(nèi)加入*液和EDTA混合液少量。以能覆蓋培養(yǎng)瓶底為宜。
(3)置37℃孵箱或室溫(25℃溫度)下進行消化,2~5min后把培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下進行觀察,當發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細胞間隙增大后,應立即中止消化。
(4)吸出消化液,向瓶內(nèi)加入Hanks液少量,輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶,把殘留消化液沖掉,然后再加培養(yǎng)液。如果僅使用*消化,在吸除胰蛋白液后,可直接加入少量含血清的培養(yǎng)液,終止消化。
(5)使用彎頭吸管,吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液,按順序反復輕輕吹打瓶壁細胞,使之從瓶壁脫離形成細胞懸液。吹打時動作要輕柔,以防用力過猛損傷細胞。
(6)用計數(shù)板計數(shù)后,分別接種于新的培養(yǎng)瓶中,置
CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。
(7)細胞培養(yǎng)換液時間應根據(jù)細胞生長的狀態(tài)和實驗要求來確定。一般2~3d后應換一次生長液。待細胞鋪滿器皿底面,即可使用;也可繼續(xù)傳代擴大培養(yǎng)或換成維持液。