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上海瑞齊生物科技有限公司

培養(yǎng)細(xì)胞的凍存及復(fù)蘇

時間:2010-9-4閱讀:1231
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細(xì)胞低溫凍存是培養(yǎng)室常規(guī)工作和通用技術(shù)。細(xì)胞凍存在-196℃液氮中,儲存時間幾乎是無限的。細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的原則是慢凍快融。
1. 凍存細(xì)胞
1)選對數(shù)增生期細(xì)胞(證明無支原體污染),在凍存前1d換液。
2)按常規(guī)方法把培養(yǎng)細(xì)胞制備成懸液,計數(shù),使細(xì)胞密度達(dá)5×107/ml左右密度,離心,去上清。
3)加入配制好的凍存液(培養(yǎng)液6.8ml,小牛血清2ml,DMSO 1ml,5.6%NaHCO3 0.1ml),按與去上清相同的量一滴一滴加入離心管中,然后用吸管輕輕吹打令細(xì)胞重懸。凍存細(xì)胞時培養(yǎng)液中加入保護(hù)劑10%二甲基亞砜(DMSO) 或甘油,可使冰點降低,使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外。
4)分裝于無菌凍存管中,每管加1.5m懸液。
5)旋好凍存管并仔細(xì)檢查,一定要蓋緊,做好標(biāo)記。
6)凍存:在特殊的儀器或簡易的液氮容器中,按-1℃/min的速度,在30~40min時間內(nèi),下降到液氮表面,再停30min后,直接投入液氮中。要適當(dāng)掌握下降冷凍速度,過快能影響細(xì)胞內(nèi)水分透出,太慢則促進(jìn)冰晶形成。
操作時應(yīng)戴防護(hù)眼鏡和手套,以免液氮凍傷。
2. 復(fù)蘇細(xì)胞
1)從罐中取出凍存管。
2)迅速放入36℃~37℃水浴,不時搖動,使其急速融化,30~60s內(nèi)完成。
3)凍存管用70%酒精擦拭消毒后,打開蓋子,用吸管將細(xì)胞懸液注入離心管中,再滴加10ml培養(yǎng)液。
4)低速離心(500~1000r/min) 5min,去上清后再用培養(yǎng)液洗一次。
5)用培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后,裝入培養(yǎng)瓶37℃培養(yǎng),次日更換一次培養(yǎng)液后,繼續(xù)培養(yǎng)。以后仍按常規(guī)進(jìn)行培養(yǎng)。
凍存細(xì)胞數(shù)量要充分,密度應(yīng)達(dá)到107/ml,在融后稀釋20倍時,仍能保持5×105/ml數(shù)量。

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