質(zhì)粒小提試劑盒實(shí)驗(yàn)操作步驟：
1. 接種菌種到1-5 ml 的液體培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)12-16 h。室溫下13,000 g離心1min，收集菌體，并盡可能的吸去上清。
注：殘留的液體培養(yǎng)基容易導(dǎo)致菌液裂解不充分，第5步離心后沉淀較松，不能有效吸取上清。
注：本說明書中的操作程序適用于標(biāo)準(zhǔn)LB（Luria Bertani）培養(yǎng)基培養(yǎng)12-16 小時(shí)后，培養(yǎng)液OD600（細(xì)菌密度）在2.0-3.0之間的菌液。若采用的是富集培養(yǎng)基，例如TB 或2×YT，請(qǐng)注意保證OD600不超過3.0。
2. 加入250 µl Buffer A，用渦流震蕩充分懸浮細(xì)菌細(xì)胞。
注：細(xì)菌細(xì)胞如果沒有充分懸浮均勻，將導(dǎo)致菌體裂解不*，從而降低產(chǎn)量。
3. 加入 250 µl Buffer B, 輕輕地顛倒混勻5-10 次以混合均勻，此時(shí)溶液粘稠而澄清。
注：切勿劇烈振蕩。此步驟時(shí)間不超過5 min，時(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致基因組DNA污染或質(zhì)粒受到損傷。若溶液未清亮澄清，則表明菌體裂解不充分，應(yīng)加大Buffer B的用量或減少菌體量。
4. 加入350 µl Buffer C, 顛倒混勻5-10次，此時(shí)出現(xiàn)白色絮狀沉淀。
5. 將離心管轉(zhuǎn)至高速離心機(jī)，在室溫下13,000×g離心10 min（若上清中有白色沉淀漂浮，可再次離心）。小心吸取離心后的上清液。
6. （選做）如果質(zhì)粒擴(kuò)增菌株為BL21等高表達(dá)蛋白菌株，可向上清中加入300μl的異丙醇，上下顛倒混勻。
7. 將上一步得到的上清液添加至本試劑盒提供的吸附柱P柱中（如一次無法加完，可分多次加入，吸取時(shí)應(yīng)避免吸起沉淀），室溫下10,000 ×g離心1 min。棄掉收集管中的廢液。
8. 加入700 μl 的Buffer WB溶液（確保已加入無水乙醇），室溫下13,000×g離心1 min ，棄廢液。重復(fù)此步驟。
9. 室溫下13,000×g離心2 min以*甩下Buffer WB殘留。
10. 取出吸附柱P柱并放入新的EP管中，將吸附柱P柱開蓋室溫下開蓋靜置2 min，如有需要可放在空調(diào)風(fēng)口吹1-2 min，以*去除殘留的乙醇。
11. 向吸附柱P柱正中間加入30-100 µl (推薦50μl的溶解體積)Elution Buffer或ddH2O（56℃水浴后效果更好），靜置5min待吸附的質(zhì)粒*溶解，室溫下13,000×g離心2 min即得到提取的質(zhì)粒。
注：提取到的質(zhì)粒 DNA可直接用于基因克隆、測序、酶切、文庫篩選、體外轉(zhuǎn)錄翻譯、轉(zhuǎn)染細(xì)胞。若用于轉(zhuǎn)染內(nèi)毒素敏感性細(xì)胞株，原代細(xì)胞及用于微注射，建議去除內(nèi)毒素。
會(huì)員1.png)