人（Human ）維生素 B12（VB12）ELISA 檢測試劑盒使用說明書
[本試劑盒只能用于科學研究，不得用于醫(yī)學診斷]
檢測原理
試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗 （ ELISA ） 。 往預(yù)
先包 被 維生素 B1 2 （ VB12 ） 抗體的包被微孔中 ， 依次加入標本 、 標準
品、 HRP 標記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并*洗滌。用底物 TMB 顯色 ，
TMB 在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色 ， 并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終
的黃色 。 顏色的深淺和樣品中的 維生素 B1 2 （ VB12 ） 呈 正相關(guān) 。 用酶
標儀在 450nm 波長下測定吸光度（ OD 值 ） ，計算樣品濃度。
樣品收集、處理及保存方法
1. 血清 ： 使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管 ， 操作過程中避免任何細胞
刺激 ， 收集血液后 ， 3000 轉(zhuǎn)離心 10 分鐘將血清和紅細胞迅速小心地
分離。
2. 血漿 ： EDTA 、 檸檬酸鹽或肝素抗凝 。 3000 轉(zhuǎn)離心 30 分鐘取上清 。
3. 細胞上清液： 3000 轉(zhuǎn)離心 10 分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿 ： 將組織加入適量生理鹽水搗碎 。 3000 轉(zhuǎn)離心 10 分鐘
取上清。
5. 保存 ： 如果樣本收集后不及時檢測 ， 請按一次用量分裝 ， 凍存于
-20 ℃ ，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍 。
自備物品
1. 酶標儀（ 450nm ）
2. 高精度加樣器及槍頭 ： 0.5-10uL 、 2-20uL 、 20-200uL 、 200-1000uL
3. 37 ℃ 恒溫箱
操作注意事項
1. 試劑盒保存在 2-8 ℃ ，使用前室溫平衡 20 分鐘。從冰箱取出的
濃縮洗滌液會有結(jié)晶，這屬于正?，F(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶*溶解
后再使用。
2. 實驗中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中 ， 密封 （ 低溫干燥 ） 保存
3. 濃度為 0 的 S0 號標準品即可視為陰性對照或者空白；按照說明書操作時樣本已經(jīng)稀釋 5 倍，zui終結(jié)果乘以 5 才是樣本實際濃度。
4. 嚴格按照說明書中標明的時間、加液量及順序進行溫育操作。
5. 所有液體組分使用前充分搖勻。
試劑盒組成
名稱 96 孔配置 48 孔配置 備注
微孔酶標板 12 孔 × 8 條 12 孔 × 4 條 無
標準品 0.3mL*6 管 0.3mL*6 管 無
* 6mL 3mL 無
檢測抗體 -HRP 10mL 5mL 無
20 × 洗滌緩沖液 25mL 15mL 按說明書進行稀釋
底物 A 6mL 3mL 無
底物 B 6mL 3mL 無
終止液 6mL 3mL 無
封板膜 2 張 2 張 無
說明書 1 份 1 份 無
自封袋 1 個 1 個 無
注：標準品（ S0-S5 ）濃度依次 為： 0 、 30 、 60 、 120 、 240 、 480 pmol/ L
試劑的準備 試劑的準備 試劑的準備 試劑的準備
20 × 洗滌緩沖液的稀釋 ： 蒸餾水按 1 ： 20 稀釋 ， 即 1 份的 20 × 洗滌緩
沖液加 19 份的蒸餾水。
洗板方法
1. 手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，靜置 1min 后甩盡
孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，如此洗板 5 次。
2. 自動洗板機：每孔注入洗液 350 μ L ，浸泡 1min ，洗板 5 次。
操作步驟
1. 從室溫平衡 20min 后的鋁箔袋中取出所需板條 ， 剩余板條用自封
袋密封放回 4 ℃ 。
2. 設(shè)置標準品孔和樣本孔 ， 標準品孔各加不同濃度的標準 品 50 μ L ；
3. 樣本孔先加待測樣本 10 μ L ，再加* 40 μ L ；空白孔不
加。
4. 除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶
（ HRP ）標記的檢測抗體 100 μ L ，用封板膜封住反應(yīng)孔， 37 ℃ 水浴
鍋或恒溫箱溫育 60min 。
5. 棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置 1min ，甩去
洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板 5 次（也可用洗板機洗板 ） 。
6. 每孔加入底物 A 、 B 各 50 μ L ， 37 ℃ 避光孵育 15min 。7. 每孔加入終止液 50 μ L ， 15min 內(nèi) ， 在 450nm 波長處測定各孔 的
OD 值。
結(jié)果判斷
繪制標準曲線：在 Excel 工作表中，以標準品濃度作橫坐標，對 應(yīng)
OD 值作縱坐標 ， 繪制出標準品線性回歸曲線 ， 按曲線方程計算各樣
本濃度值。
試劑盒性能
1. 準確性：標準品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù) R 值，大于等 于
0.9900 。
2. 靈敏度：zui低檢測濃度小于 1 .0 pmol/ L 。
3. 特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。
4. 重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于 15% 。
5. 貯藏： 2-8 ℃ ，避光防潮保存。
6. 有效期： 6 個月
免責聲明
1. 試劑盒僅供研究使用，不得用于臨床實驗或人體實驗，否則所
產(chǎn)生的一切后果，由實驗者承擔，本公司概不負責。
2. 嚴格按照說明書操作，實驗者違反說明書操作，后果由實驗者
承擔。
