簡介
趨化因子（C-C motif）配體8/單核細胞趨化因子2（CCL8/MCP-2）由97個氨基酸組成，屬于C-C亞族．CCL8/MCP-2由單核細胞，纖維母細胞和上皮細胞產(chǎn)生，
對CD4+ T細胞，CD8+ T細胞和NK細胞具有趨化活性．盡管CCL8/MCP-2在小鼠體內(nèi)的生物活性仍存在未知之?dāng)?shù)，但近期有報告表明，血漿中CCL8/MCP-2濃度上升與移植物抗宿主?。℅VHD）的發(fā)病有密切，這種病癥是一種骨髓移植并發(fā)癥，并且研究表明CCL8/MCP-2與小鼠機體內(nèi)的免疫反應(yīng)息息相關(guān)．
實驗原理
此試劑盒是一種夾心法的酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，使用了兩種高特異性的抗體。TMB作為顯色劑，zui終溶液所顯示的顏色強度與小鼠樣品中CCL8/MCP-2的量成正比
檢測范圍
78.13 ～5,000 pg/mL
預(yù)期用途
僅用于研究，不可用于診斷
此試劑盒可用于小鼠血清，EDTA血漿和肝素血漿中CCL8/MCP-的定量檢測
試劑盒成分
- 包被板，包被了抗小鼠CCL8/MCP-2（81）兔IgG 96孔
- 標(biāo)記抗體，
30X濃縮，HRP標(biāo)記抗小鼠CCL8/MCP-2兔IgG單抗，F(xiàn)ab'親合純化 0.4ml x 1
- 標(biāo)準品，重組小鼠CCL8/MCP-2 0.5mlx 2
- EIA緩沖液，1%的BSA，含0.05%的吐溫20的PBS 30mlx 1
- 標(biāo)記抗體稀釋液，1%的BSA，含0.05%的吐溫20的PBS 12mlx 1
- 顯色劑，TMB， 15mlx 1
- 終止液，1N硫酸， 12mlx 1
- 洗滌緩沖濃縮液，40X濃縮，0.005%吐溫20的磷酸緩沖液 50mlx 1
實驗所需材料但試劑盒未提供酶標(biāo)儀（450nm） 移液器和槍頭
帶刻度的量筒和燒杯 去離子水
冰箱（4℃） 坐標(biāo)紙（對數(shù)/對數(shù)）
吸水紙 標(biāo)準品稀釋試管
保溫箱（37±1℃） 洗瓶
一次性試管
試劑準備
- 洗滌緩沖液制備：試劑盒的洗滌液為40倍濃縮，使用前，先將洗滌濃縮液平衡至室溫，充分混勻，然后吸取50ml濃縮液與1950ml的去離子水混勻，即得。配制的稀釋洗滌液應(yīng)保存于冰箱內(nèi)，并于2周內(nèi)用完
- 稀釋標(biāo)記抗體的制備：用標(biāo)記抗體稀釋液將標(biāo)記抗體稀釋30倍，即得。
例：如果只測一條板，8孔，則需要標(biāo)記抗體800ul（30ul的濃縮標(biāo)記抗體+870ul的標(biāo)記抗體稀釋液，混勻，使用時每孔加100ul）
此步驟在實驗開始前完成
剩余的標(biāo)記抗體濃縮應(yīng)裝于密封瓶內(nèi)，保存在4℃
- 標(biāo)準品的制備：吸取0.5ml的去離子水至標(biāo)準品瓶內(nèi)，充分混勻，得到濃度為10,000 pg/mL的小鼠CCL8/MCP-2標(biāo)準品
- 標(biāo)準品的稀釋：準備8個試管用于標(biāo)準品的稀釋，每管加入230ul的EIA緩沖液
每管的濃度如下
1號管 5,000 pg/mL
2號管 2,500 pg/mL
3號管 1,250 pg/mL
4號管 625 pg/mL
5號管 312.5 pg/mL
6號管 156.25 pg/mL
7號管 78.13 pg/mL
8號管 0ng/ml（試驗樣品空白）
吸取230ul的濃度為10,000 pg/mL的標(biāo)準品至1號管混勻，然后從1號管吸取230ul加入2號管，依次連續(xù)稀釋，標(biāo)準品范圍為78.13－5,000 pg/mL .8號管為濃度為0 pg/mL
- 樣品稀釋：樣品如需稀釋，請用EIA緩沖液稀釋，一般情況下，正常小鼠的血清和血漿樣品，建議大概稀釋倍數(shù)為200－500倍．然而，稀釋率應(yīng)視各實驗室具體情況優(yōu)化，因為小鼠CCL8/MCP-2隨個體免疫狀態(tài)和品種等的不同而不同．
實驗步驟使用前，所有樣品應(yīng)平衡至室溫，大約30min，然后充分混勻，確保試劑質(zhì)量無變化，標(biāo)準曲線和樣品檢測同時進行
| 試劑 | 樣品 | 標(biāo)準品 | 樣品空白 | 試劑空白 |
| 檢測樣品100ul | 稀釋標(biāo)準品（1-7管）100ul | EIA緩沖液（第8管）100ul | EIA緩沖液100ul |
| 蓋板，37℃下溫育60min |
| 洗板7次 |
| 酶標(biāo)抗體 | 100ul | 100ul | 100ul | - |
| 蓋板，4℃下溫育30min |
| 洗板9次 |
| 顯色劑 | 100ul | 100ul | 100ul | 100ul |
| 室溫避光溫育30min |
| 終止液 | 100ul | 100ul | 100ul | 100ul |
| 加終止液后30min內(nèi)于450nm處讀取OD值 |
- 設(shè)試劑空白對照孔，并在相應(yīng)的微孔中加入100ul EIA緩沖液。
- 確定好樣品空白孔，樣品孔和標(biāo)準品孔，然后分別將100ul樣品空白（8號管）、檢測樣品和稀釋好的標(biāo)準品（1-7號管）加入到相應(yīng)的微孔中。
- 蓋板，37℃下溫育60min
- 用洗瓶劇烈洗板，再在微孔中加入洗滌液靜置15－30秒，灑棄洗滌液。重復(fù)7次，zui后在吸水紙上拍干
如果用自動洗板機洗板，先自動洗板4次，再按上述手動洗板3次
- 每孔加100ul稀釋標(biāo)記抗體，除試劑空白對照孔外
- 蓋板，4℃下溫育60min
- 按照步驟4）洗板9次
- 取所需量的顯色劑加入到試管中，然后在每一微孔中加入100ul顯色劑。
為了避免污染，請勿將剩余試劑在倒入原裝試劑瓶中。
- 室溫避光溫育30min，加入顯色劑后溶液顏色會變成藍色
- 在每孔加100ul終止液，輕敲板邊混勻，此時溶液顏色會變成黃色
- 擦去微孔板底部的污垢或水滴并確定反應(yīng)液無氣泡產(chǎn)生，加終止液后30min內(nèi)在酶標(biāo)儀450nm處讀數(shù)
特別注意
- 試驗樣品采集后應(yīng)立即檢測或是凍存，凍存的樣品避免反復(fù)凍融，檢測前應(yīng)在低溫下先將其*溶解混勻
- 試驗樣品用EIA緩沖液稀釋
- 試驗樣品和標(biāo)準品建議做雙份檢測
- 試驗樣品應(yīng)在中性PH范圍，有機溶劑的污染可能會影響檢測結(jié)果
- 只能用試劑盒提供的洗滌液洗板，不充足或過多的洗滌會導(dǎo)致試驗失敗
- 吸水紙上拍干微孔板，不能擦拭
- TMB底物液應(yīng)貯存于黑暗處，因其對光敏感，且避免接觸金屬
- 加入終止液后30min內(nèi)必須于酶標(biāo)儀讀數(shù)
結(jié)果計算繪制曲線前，所有的數(shù)據(jù)都應(yīng)減去試驗樣品空白值，包括標(biāo)準品和未知的樣品。以標(biāo)準品的OD值和濃度在對數(shù)-對數(shù)坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準曲線，從標(biāo)準曲線上可直接讀取未知樣品的濃度
以上典型標(biāo)準曲線僅供演示說明用，不能用于試驗數(shù)據(jù)的獲取，每次試驗都應(yīng)建立標(biāo)準曲線
