1、應用范圍
此試劑盒可用于人血漿和尿液中組胺的體外定量檢測。深化此實驗可用于細胞培養(yǎng)上清液的研究。
2、前言說明
組胺（β-咪唑乙胺）是人體中zui重要的介質，它主要存在于過敏反應的起始階段（速發(fā)型過敏）。組胺是由組胺酸經(jīng)脫氨基作用產(chǎn)生的。組胺幾乎存在于機體的所有組織中，主要儲存于柱狀細胞和嗜堿性粒細胞的異染性顆粒中。組胺通常都是以無活性的復合體性存在，只有當需要的時候才會釋放。像其它的介質一樣，組胺不僅能調(diào)節(jié)過敏反應的各種臨床癥狀，也可以調(diào)節(jié)終止過敏反應的一系列效應。組胺在組織中的生物活性是通過三種受體來完成的，它們分別是H1，H2和H3受體。臨床檢測組胺的方法有：定量檢測各種速發(fā)型過敏反應中嗜堿性白細胞釋放組胺的量，也可以檢測過敏藥物治療后各種體液（血漿，尿液，細胞培養(yǎng)上清）中組胺的量。
3、實驗原理
此ELISA試劑盒利用的是競爭法的原理。樣品中未知量的抗原和一定量的酶標抗原競爭性結合到包被在微孔中的抗體結合位點上。溫育后洗板以終止競爭反應。加入底物液后，溶液所顯示的顏色強度與樣品中抗原的量成反比。樣品的實驗結果可以從標準曲線上直接獲取。
4、儲存與穩(wěn)定性
試劑盒必須在2-8℃的環(huán)境下運輸和儲存，避免太陽直射。樣品的儲存與穩(wěn)定性及試劑準備將在相關章節(jié)中闡述。如果將包被板密封并儲存于2-8℃的環(huán)境下時，試劑在有效期內(nèi)穩(wěn)定。
5、樣品的采集與儲存
血漿（EDTA，肝素）
按照靜脈穿刺的常規(guī)注意事項采集樣品，血液樣品自采集到實驗時都必須保證其化學完整性。不要使用明顯溶血、黃疸和脂血樣品?；鞚岬臉悠窇斣趯嶒為_始前離心以除去所有的顆粒性物質。 |
儲存 | 2-8℃ | ≤-20℃ | ≤-70℃ | 避免太陽直射，避免反復凍融。 |
穩(wěn)定性 | 5小時 | 3個月 | 2年 |
尿液
實驗必須使用自然產(chǎn)生的尿液，也可使用24小時內(nèi)產(chǎn)生的尿液。收集病人24小時內(nèi)產(chǎn)生的尿液，并混合于含10-15ml 6N HCl防腐劑的容器中。為了計算結果，請確定尿液的總體積。實驗開始前請先將樣品離心。 |
| 自然的尿液 | 酸化尿液 | | 避免太陽直射，避免反復凍融。 |
儲存 | 2-8℃ | 2-8℃ | ≤-20℃ |
穩(wěn)定性 | 8小時 | 3天 | 6個月 |
細胞培養(yǎng)上清
使用細胞培養(yǎng)上清作樣品，一般沒特殊注意事項 細胞培養(yǎng)基內(nèi)的組胺濃度可能稍微要高些。 |
全血
全血中組胺釋放量的檢測必須用肝素化全血，具體信息請見相應的說明書（RE95000） |
6、試劑盒成分
注意：試劑盒有足夠做96份單孔檢測或48份雙孔檢測所需的試劑成分
數(shù)量 | 標記 | 成分 |
1×12×8 | MTP | 包被板，可拆，微孔中包被了羊抗兔抗血清。 |
1×5ml | ANTISERUM | 組胺抗血清，藍色，即用，內(nèi)含：兔抗血清、Tris緩沖液和0.01%的硫柳汞 |
1×75ul | ENZCONJ CONC | 酶聯(lián)物，200倍濃縮，內(nèi)含辣根過氧酶標記的組胺。 |
7×0.4ml | CAL P A-G LYO | 血漿標準品A-G，凍干，用于血漿樣品的定標。內(nèi)含：組胺、人血漿。具體濃度請見試劑瓶標簽或質控單。 |
2×0.4ml | CONTROL P1+2 LYO | 血漿質控1+2，凍干，內(nèi)含：組胺、人血清。具體濃度及可允許范圍請見試劑瓶標簽。 |
1×2.0ml 5×0.25ml | CAL U/C A-F | 尿液/細胞培養(yǎng)標準品A-F，0;2.7;8.1;24.3;73;219ng/ml,即用，用于尿液和細胞培養(yǎng)樣品的定標。內(nèi)含：組胺和0.1M的HCl。 |
2×0.25ml | CONTROL U/C 1+2 | 尿液質控1+2，即用，內(nèi)含：組胺、人尿液（酸化的）。具體濃度及可允許范圍請見試劑瓶標簽。 |
1×2.25ml | ACYLREAG | ?；噭从?，內(nèi)含：DMF |
1×60ml | ASSAYBUF CONC | 檢測緩沖液，5倍濃縮，內(nèi)含Tris緩沖液、吐溫、BSA和0.05%的硫柳汞。 |
1×50ml | WASHBUF CONC | 洗滌液，20倍濃縮，內(nèi)含磷酸緩沖液、吐溫和0.1%的硫柳汞。 |
1×10ml | INDICATORBUF | 指示緩沖液，紫色，即用，內(nèi)含：Tris緩沖液、*（pH＜7.5時顏色會發(fā)生改變＝和0.1%的硫柳汞。 |
1×12ml | TMB SUBS | TMB底物液，即用，內(nèi)含TMB、緩沖液和穩(wěn)定劑。 |
1×12ml | TMB STOP | TMB終止液，即用，1M的H2SO4。 |
3× | FOIL | 粘性金屬板 |
7、實驗所需器材但試劑盒不提供
1）移液器，體積：10;20;50;100;1000ul
2）試管（12×75mm）
3）試管架
4）振蕩器
5）旋渦混合器（500rpm）
6）帶儲器的8道移液器
7）洗滌瓶，自動或半自動洗板機
8）酶標儀（參考波長：600-650nm）
9）蒸餾水或去離子水
10） 吸水紙、取樣吸頭和計時器
8、實驗前的準備說明
注意 | 96人份的試劑盒可分成三份分別進行檢測，下述體積為檢測32人份時所需要的體積。 |
8.1凍干或濃縮成分的準備
稀釋/溶解 | 成分 | | 稀釋劑 | 比例 | 備注 | 儲存 | 穩(wěn)定性 |
20ml | 檢測緩沖液 | 100ml | 蒸餾水 | 1：5 | | 2-8℃ | 2周 |
15ml | 洗滌液 | 300ml | 蒸餾水 | 1：20 | 18-25℃將晶體溶解掉 | 2-8℃ | 4周 |
| 血漿標準品 | 0.4ml | 蒸餾水 | | 靜置15min,混合時無泡沫 | -20℃ | 1個月 |
| 血漿質控品 | 0.4ml | 蒸餾水 | | 靜置15min,混合時無泡沫 | -20℃ | 1個月 |
10ul（*） | 酶聯(lián)物 | 2ml | 檢測緩 沖液 | 1:200 | 臨時配置,只能使用一次 | 18-25 ℃ | 30分鐘 |
（*）在稀釋前,確保塞子內(nèi)無殘留液體.
8.2樣品的稀釋
樣品中組胺濃度高于zui高標準品的樣品,應當在?；坝孟鄳南♂屢合♂?span lang="EN-US">,尿液樣品用0.1M的HCl,血漿樣品用樣品稀釋液（Cat.no. KEHP711）,試劑盒內(nèi)未提供。
8.3樣品的?；?/span>
用試管準備樣品
注意 | 不能血漿標準曲線確定?；蛞夯蚣毎囵B(yǎng)樣品中組胺的濃度,也不能用U/C標準曲線確定?；獫{樣品中組胺的濃度. |
8.3.1血漿
1 | 將血漿標準品、血漿質控品和病人樣品分別100ul加入到相應的試管中。 |
2 | 在每一試管中加入100ul指示緩沖液，旋渦混合。 |
3 | 在每一試管中加入20ul?；噭尤膈；噭┖罅⒓葱郎u混合。 |
4 | 將試管蓋好，室溫（18-25℃）溫育30分鐘。 |
5 | 在每一試管中加入750ul已稀釋好的檢測緩沖液，旋渦混合。 |
8.3.2尿液，細胞培養(yǎng)上清
1 | 將U/C標準品、尿液質控品和病人尿液或細胞培養(yǎng)上清分別50ul加入到相應的試管中。 |
2 | 在每一試管中加入50ul指示緩沖液，旋渦混合。如果指示劑變成無色，說明溶液的pH值很低，樣品中含有很多酸性物質。在這種情況下，再向試管中加入50ul指示緩沖液直至溶液略帶微紅。 |
3 | 在每一試管中加入10ul?；噭?，加入?；噭┖罅⒓葱郎u混合。 |
4 | 將試管蓋好，室溫（18-25℃）溫育30分鐘。 |
5 | 在每一試管中加入2000ul已稀釋好的檢測緩沖液，旋渦混合。 |
注意：酰化處理好的樣品可在2-8℃下存放一晚，-20℃環(huán)境下可存放2天。
9、實驗步驟
1 | 將?；幚磉^的標準品、質控品和病人樣品分別50ul加入到相應的微孔中。 |
2 | 在每一微孔中加入50ul臨時配置好的酶聯(lián)物。 |
3 | 在每一微孔中加入50ul組胺抗血清。 |
4 | 蓋板，振蕩器（500rpm）上室溫溫育3小時。 |
5 | 移去粘性金屬板，棄取孔內(nèi)反應物，每孔用250ul稀釋好的洗滌液洗板4次，吸水紙上拍干以除去殘余液體。 |
6 | 如果有條件的話，可以用8道移液器加底物液和終止液。加底物液和終止液時，每孔的時間間隔應當相同。使用主動置換型移液器并避免氣泡產(chǎn)生。 |
7 | 在每一微孔中加入100ul TMB底物液。 |
8 | 血漿：振蕩器（500rpm）上室溫溫育40min。 尿液/細胞培養(yǎng)上清：振蕩器（500rpm）上室溫溫育20min。 |
9 | 在每一微孔中加入100ul TMB終止液以終止底物反應。輕輕振板使溶液混合均勻。 |
10 | 加終止液后15min內(nèi)450nm處讀取OD值。（參考波長：600-650nm） |
10、期望值
實驗結果不能當作任何治療結果的*原因，疾病的判斷還應當與其它臨床觀察和診斷檢測相結合。以下結果為正常人群的正常值（5%-95%），建議每個實驗室讀確定自己的正常值范圍：
血漿 | 尿液 |
| 24小時尿液 | 自然產(chǎn)生的尿液 |
ng/ml | ug/d | ug/g肌酐酸 |
0.2-1.0 | 5-56 | 8-53 |
