SPA可為多種示蹤物（如熒光素、酶、膠體金、鐵蛋白）所標(biāo)記，應(yīng)用較廣泛的為酶標(biāo)記SPA和金標(biāo)記SPA技術(shù)。標(biāo)記SPA常用的酶為HRP，可應(yīng)用于間接法染色，SPA在PAP法中可代替橋抗體。
1．SPA—HRP在間接法中的應(yīng)用
由于SPA能結(jié)合IgG的Fc段，因此就成為天然的抗IgG，酶標(biāo)記的SPA可代替酶標(biāo)記的IgG抗血清，從而測(cè)定和定位組織內(nèi)的IgG或免疫復(fù)合物，SPA—HRP的染色步驟如下。
（1）石蠟切片常規(guī)脫蠟至水。
（2）3％H202處理15min，以抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶
（3）TBS洗3X3min。
（4）加*抗體，孵育30～60min，或4~C過(guò)夜。
（5）TBS洗3X 3min。
（6）加適當(dāng)?shù)南♂尩腟PA—HRP（1：100～1：400），孵育30—60min。
（7）TBS洗3X3min。
（8）DAB顯色5—10min。
（9）復(fù)染、脫水、封片。
2．SPA在PAP法中的應(yīng)用
SPA除與標(biāo)記物結(jié)合后用于代替第二抗體外，其本身可作為橋抗體用于PAP染色。與標(biāo)記SPA相似，SPA可與多種動(dòng)物的*抗體反應(yīng)外，還可與多種PAP復(fù)合物反應(yīng)，而不像PAP法需要與*抗體相同的動(dòng)物制備的各種PAP復(fù)合物。由于SPA與Fc段和Fab段結(jié)合為親和化學(xué)反應(yīng)，不是抗原—抗體的免疫反應(yīng)，因而反應(yīng)極為迅速，能大大減少實(shí)驗(yàn)時(shí)間。此法的敏感性不如PAP法，但背景染色要低于PAP法，而且較為方便。染色步驟如下。 （1）4gm石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，PBS洗3X3rain。
（2）IHC的前處理視特異性一抗不同，可采用蛋白酶消化或熱誘導(dǎo)的微波抗原修復(fù)（AR）。
（3）PBS洗3X3min。
（4）3％過(guò)氧化氫（Hz02）孵育10min（可省略），以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。
（5）PBS洗3X3min。
（6）20％蛋清[用0．01mol／L（pH7．3）PBS配制]孵育20min。
（7）PBS洗3X3min。
（8）10％非免疫性動(dòng)物血清孵育10min（可省略），以減少非特異性背景，無(wú)需沖洗，只需吸去多余血清。
（9）滴加適當(dāng)稀釋的*抗體，37~C溫育60min，或4~C過(guò)夜。
（10）PBS洗3X 3rain。
（11）加SPA（1ug／mi），37~C溫育30rain。
（12）PBS洗3X3rain。
（13）PAP復(fù)合物（兔或鼠）37~C溫育30min。
（14）PBS洗3X3rain。
（15）0．04％DAB（含0．03％Hz02）顯色5～10min
（16）復(fù)染，脫水，常規(guī)樹(shù)膠封固，結(jié)果觀察。
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