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DNA合成的亞磷酰胺三酯法

閱讀：3799發(fā)布時間：2011-10-17

亞磷酰胺三酯法合成DNA片段，已被DNA合成儀廣泛使用，使得合成DNA片段成為一件非常簡單易行的工作。亞磷酰胺三酯法是將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成的，合成的方向是由待合成引物的3’端向5’端，相鄰的核苷酸通過3，一5，磷酸二酯鍵連接。

合成的*步是將預先連接在固相載體上其活性基團被保護的核苷酸與三氯乙酸反應，脫去其5，—羥基的保護基團DMT，獲得游離的5，—羥基；

第二步，合成DNA的原料（亞磷酰胺保護核苷酸單體）與活化劑四氮唑混合，得到反應活性很高的核苷亞磷酸活化中間體（它的3’端被活化，5’—羥基仍然被DMT保護），與溶液中游離的5，—羥基發(fā)生縮合反應，這個反應時間很快。

第三步是帶帽反應，縮合反應中可能有的極少數(shù)5，—羥基沒有參加反應（合格的合成試劑縮合效率一定會大于98％，所以未參加反應的少于2％），合成過程使用乙酸酐和l—甲基咪唑使這些核苷5’—羥基反應形成酰，終止其后繼續(xù)發(fā)生反應，這種短片段可以在純化時分離掉。這步反應同樣是快速的；

第四步，縮合后在氧化劑碘的作用下，亞磷酰形式轉變?yōu)楦€(wěn)定的磷酸三酯。

經過以上四個步驟，一個脫氧核苷酸被連接到固相載體的核苷酸上。再以三氯乙酸脫去它的5’—羥基上的保護基團DMT，重復以上步驟，直到所有要求合成的堿基被接上去。


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