1．熱修復(fù)方法
（1）微波法 96~C，10minX2。
（2）直接加溫法 100~C，10min。
（3）水浴鍋法 100~C，10minx2。
（4）高壓鍋／消毒鍋法 120~C，5min。
（5）真空加熱法 10min。
修復(fù)方式對結(jié)果影響不是很大，主要與修復(fù)溫度有關(guān)，但以微波和水浴鍋法較為穩(wěn)定。
2．熱修復(fù)的介質(zhì)
（1）0。01mol／lpH6．0檸檬酸緩沖液（CB）
（2）0．05mol／lTris—HCl（pHI～12系列）。
（3）0．01mol／l pH7。0 PBS。
（4）2％硫酸鋁。
（5）2％硝酸鋁。
（6）生理鹽水。
（7）蒸餾水。
（8）0．05mol／LpH8。0 EDTA。
（9）0．05mol／LTris-EDTA，pH9．0。
文獻(xiàn)報道多數(shù)認(rèn)為溶液的摩爾濃度對修復(fù)效果影響較小，而pH值則影響較大。緩沖液以檸檬酸緩沖液和Tris—HCl較常用。
3．溫度與修復(fù)時間的關(guān)系
許多實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，溫度越高修復(fù)時間越短，溫度與修復(fù)時間呈負(fù)相關(guān)。例如K167和P-gp的檢測，利用同一切片，達(dá)到相同的染色結(jié)果需要：①100~C，20min；②90~C，30min；③80~C，50min；④70~C，20h。
4．操作流程
（1）微波處理 將切片插人切片塑料架上，在250ml塑料盒內(nèi)加入200ml緩沖液，用微波加溫至96~C （大約1～2min），并將切片移人修復(fù)液中，微波4擋保持96℃20min，取出自然冷卻至室溫。
（2）水浴鍋法 熱水浴是一種傳統(tǒng)的抗原修復(fù)方法，調(diào)節(jié)水溫使標(biāo)本達(dá)95~C，將切片置人內(nèi)含200ml緩沖液的塑料盒內(nèi)，溫度平衡后開始計時20min，取出塑料盒后自然冷卻至室溫。
（3）壓力鍋法 在高壓鍋內(nèi)加入一定量的緩沖液，加溫至煮沸，將切片插入切片架并置人鍋內(nèi)，蓋上鍋蓋，不加閥，開始噴氣時計時5min，關(guān)閉氣閥，使之加壓10min。壓力鍋置于流水槽中沖洗10min，冷卻后取出切片，PBS洗滌。
5.*AR方法的測定
根據(jù)表2—6設(shè)計實(shí)驗(yàn)，依據(jù)設(shè)計處理后的IHC染色切片結(jié)果，選取陽性強(qiáng)度和陽性率*、抗原的定位準(zhǔn)確、無非特異性染色的AR方法。
表2-6 選擇*修復(fù)方法的實(shí)驗(yàn)設(shè)計
檸檬酸緩沖液 pills2 pH6 pHl0~11
Tris-HCl緩沖液 pills2 oH7~8 pHl0~11
微波 100~C 10minX2 切片l 切片2 切片3
壓力鍋 120~C 10min 切片4 切片5 切片6
微波或水浴鍋 90~C 30min 切片7 切片8 切片9
切片10作陽性對照，不作任何處理
6.應(yīng)注意的問題
在操作過程中還應(yīng)注意如下問題。
（1）熱處理后應(yīng)注意自然冷卻。
（2）熱處理液不要蒸發(fā)干。
（3）不要任何抗原的檢測都使用該方法。
（4）同一批抗原的檢測溫度和時間一定保持一致。
（5）形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)的改變。一般經(jīng)高溫修復(fù)后胞漿無明顯的破壞，而對細(xì)胞核的影響較大．會出現(xiàn)核破裂、蘇木精淡染等現(xiàn)象。而經(jīng)酶水解的切片，其細(xì)胞漿破壞要視消化時間而異．但核的破壞較輕。
（6）如果用常用的緩沖液無法實(shí)現(xiàn)抗原修復(fù)，或經(jīng)修復(fù)后抗原定位發(fā)生改變，可改用一些不常用的緩沖液或加一些螯合劑（如EDTA和EGTA等），均可改善某些抗原的修復(fù)。
會員1.png)